生物技术制药教学工作总结（共3篇）

第1篇：生物技术制药总结

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术

1基因工程制药：利用基因重组技术将外援基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。

2.载体：是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外援基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

细胞传代paage：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作。细胞克隆培养（clonal culture）：即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。

动物细胞的复苏：其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

细胞融合（cell fusion）：是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象，或称细胞杂交。

转基因动物（transgenic animal）：采用基因工程技术将外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，在经过发育途径将外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为转基因动物。

胚胎干细胞（embryo stem cell）：简称ES细胞，是从早期胚胎细胞团分离出来并能在体外培养的一种高度未分化的、具有形成所有成年细胞类型能力的全能干细胞。它是正常二倍体型，像早期胚胎细胞一样具有发育上的全能性。

抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、细胞工程（包括动物细胞工程和植物细胞工程）和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）：简称单抗，将能大量扩增和永生的骨髓瘤细胞和能合成分泌特异性抗体的B细胞（仅识别一种抗原表位）进行融合得到杂交瘤细胞，经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌抗单一抗原表位的特异性抗体。

杂交瘤细胞克隆化（cloning）：是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。融合后的杂交瘤细胞一般要经过3次克隆化才能达到100%的阳性克隆。

双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）：亦称双功能抗体，是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。嵌合抗体（chimeric antibody）：是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体分子中轻、重链的V区是异源的，而C区是人源的，即整个抗体分子的60%~70%是人源的。

人源化抗体（humanized antibody，hAb）：通过CDR移植即把鼠抗体的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体的可变区内所得到的抗体，也称CDR移植抗体或改型抗体。该抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持了人抗体的功能（C区的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增值、分化，最终产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）的特性。

免疫反应性（immunoreactivity）：抗原与相应免疫效应物质在体内或体外相遇时，可发生

特异性结合而产生免疫反应的特性。

减毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通过不同的方式手段使病原体的毒性即致病

性减弱或丧失后获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。

灭活疫苗（inactivated）：是将病原体经培养增殖、灭活纯化处理，使其完全丧失感染性，但保留了病原体的几乎全部组分因此灭活疫苗具有较好的免疫原性和安全性。

亚单位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成、能诱发

机体产生抗体的疫苗。

分解代谢阻遏（catabolite repreion）：在菌体的生长阶段被菌体快速利用的碳源会产

生大量的分解产物，这些代谢产物阻遏次级代谢酶系的合成，只有当这类碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段，这种发酵过程中的次级代

谢产物在碳源被消耗尽时才产生和积累的现象称为分解代谢阻遏。

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原

理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。

种龄（inoculumage）：种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时得培养时间

生物技术药物的特性？

（1）理化性质特性（1）相对分子量大（2）结构复杂：蛋白质和核酸均为生物大分子，蛋

白质含有四级结构（3）稳定性差（2）药理学作用特性（1）活性与作用机制明确：活性物

质对生理功能的调节机制比较清楚（2）作用针对性强：有特定的靶分子、靶细胞或靶器官

（3）毒性低：生物技术药物本身是体内天然存在的物质或它们的衍生物（4）体内半衰期短

（5）有种属特异性（6）可产生免疫原抑制（3）生产制备特性（1）药物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目标产物的杂质：应采取快速分离纯化的方法以除去影响

目标产物稳定性的物质（3）制备工艺条件温和：目的产物不稳定（4）分离纯化困难：需要

多种不同原理的层析单元操作才能达到要用的纯度（5）产品易受有害物质（4）质量控制特

性

质粒的特点：（1）是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。（2）质粒

具有遗传传递和遗传交换的能力（3）质粒具有不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不

能在同一宿主细胞中稳定共存。4..共价闭合环状DNA(ccDNA)，开环DNA(ocDNA)，线状

DNA(lDNA)在琼脂糖凝胶电泳中

5.复制子松弛型复制子的复制和宿主蛋白的合成功能

无关，宿主染色体DNA复制受阻时，质粒仍可复制；严谨型复制子的复制与宿主蛋白质的合成相关，因此在每个宿主细胞中为低拷贝数，仅1~3个。

6.克隆表达的质粒载体涉及三个要素：

（1）复制子（2）选择标记：由质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于鉴定和筛选

转化有质粒的宿主细胞。常见的标记：氨苄西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位点

（MCS）：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制备方法

(1)化学合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通

过下列步骤扩增DNA：a）变性：双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；b）退火：降

低温度，引物与单链模板结合；c）延伸：温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，最终与单链

模板形成双链，并开始下一个变性、退火、延伸循环。（3）基因文库法（4）cDNA文库法

8.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之间的连接方式：粘性末端的连接效率高于平头末端。（2）目的基因与载

体的浓度和比例：增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因与载体DNA的摩尔数比应大

于1.（3）连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲液。

9.重组DNA导入大肠杆菌，常用的感受态细胞制备方法：氯化钙法

10.重组子的筛选与鉴定：

（1）载体遗传标记法：a)抗生素抗性筛选法

b)互补筛选法：重组子转化成宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷性突变发生

互补作用，从而实现重组子的筛选。蓝白斑筛选：lacZα基因可编码β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷型β—半乳糖苷酶α实现互补，可分解底物5-溴-4-

氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成蓝色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空载体的宿主细胞呈蓝色。c)营养缺陷筛选法d噬菌斑筛选法(2)核酸分子杂交法

(3)限制性内切酶图谱法(4)DNA序列测定法：双脱氧终止法(5)目的基因表达产物测定法

12.外源基因在大肠杆菌中的表达形式：

(1)胞内表达：(a)非融合蛋白的胞内表达：形成包涵体（B）融合蛋白的胞内表达：在大肠杆

菌内较稳定（2）分泌表达：（a)分泌至周质（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表达的重要调控元件

(1)启动子：是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，是决定外源基

因在原核生物中表达效率的关键因素。(2)核糖体结合位点：SD序列(3)终止子

13.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素：(1)外源基因密码子：偏好密码子（蛋白质合成迅速，错配率低）和稀有密码子(2)mRNA结构：减少G、C含量，增加A、T含量(3)表达

载体：高拷贝数、适用范围广、稳定性高、表达产物容易纯化(4)外源蛋白稳定性

14.分离纯化技术应满足下列要求：(1)技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；(2)选

择性要好(3)回收率要高(4)两个技术之间要能直接衔接(5)整个分离纯化过程要快

15.基因重组蛋白的主要分离技术

(1)离心(2)沉淀(3)膜分离(4)双水相萃取

16基因重组蛋白的主要纯化技术:

(1)离子交换层析(2)亲和层析(3)凝胶过滤层析(4)反相层析和疏水层析

17.选择分离纯化方法的依据：

（元，层析分离次序的选择也同样重要。(3)根据分离纯化工艺的要求来选择(a)具有良好的稳

定性、重复性和较高的安全性(b)尽可能减少组成工艺的步骤(c)分离纯化工艺所用的时间要

尽可能的短(d)工艺和技术必须高效

18．基因工程药物的质量控制要点

(1)蛋白质含量的测定(2)蛋白质纯度检测(3)蛋白质分子质量测定(4)蛋白质等电点测定(5)蛋

白质序列分析(6)内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析

19.蛋白质含量的测定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考马斯亮蓝法(5)SDS-PAGE扫描分析法

20.蛋白质纯度的检测：电泳法、层析法、质谱法、末端氨基酸残基分析法

21.蛋白质Mr测定有SDS-PAGE法、凝胶层析法、质谱法

22.蛋白质等电点测定的常用方法：等电聚焦法。

23.蛋白质序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为

(1)贴壁依赖性细胞(2)非贴壁依赖性细胞(3)兼性贴壁细胞

1.动物细胞培养的环境条件

(1)培养温度（哺乳类37℃，昆虫25~28℃）(2)pH值（大多数7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本营养物质(6)渗透压

3.动物细胞的培养特性

(1)比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；(2)

倍增时间长，生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；(3)对培养基要求高，易受

微生物污染，培养时需要添加抗生素；(4)生长大多需贴附于基质，相互粘连以集群形式存

在，并有接触抑制现象；(5)多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化；(6)对蛋白质的合成条件和修饰功能与细菌不同，动物细胞可对蛋白质进行完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品更一致，更适合于临床应用。

4.原代培养的主要步骤

(1)从健康动物体内无菌条件下取出适量组织，剪切成小薄片；(2)加入适宜浓度的胰蛋白酶

或胶原酶和EDTA等进行消化作用使细胞分散；(3)将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的浓度加到培养基中，37℃下进行原代培养，并适时进行传代培养。分为

组织块培养和单层细胞培养两种方法。

5.动物细胞深低温保存的基本原理

在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停滞状态，故可以长期保存。

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发

生机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起细胞

死亡。目前为了保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。

6.动物细胞的复苏

其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻

存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

7.动物细胞营养要求特点

(1)碳源不能为无机物，大多为葡萄糖；(2)氮源不能为无机物，主要为各种氨基酸；(3)在很

多情况下尚需添加5%~20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液。

8.动物细胞的大规模培养方法

(1)悬浮培养法(2)微载体培养法(3)多孔载体培养法(4)微囊化培养法(5)中空纤维培养法

9.诱导动物细胞融合的方法主要有: (1)病毒法(2)PEG法(3)电击法(4)激光法

10.转基因动物生物反应器（整体掌握？）

(1)转基因动物乳腺生物反应器（药用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)转基因动物血液生物反应器（人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白）(3)转基因动

物尿液生物反应器（促性腺激素）(4)转基因鸡（蛋）生物反应器（人干扰素）

1.单克隆抗体技术的基本原理

基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞和B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外

培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代

细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗

体的能力。通常使用HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、T为胸腺嘧啶核苷）选择培养基

对杂交瘤细胞进行筛选。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细

胞合成DNA的从头合成途径被培养基中的A阻断，又因缺乏HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸

核糖转移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成过

程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT和TK，因此能在HAT培养基

中长期存活与繁殖并分泌抗体。

2.单克隆抗体的大量制备主要方法:（1）体内培养法（2）体外培养法

6.重组ScFv的应用:(1)用于构建和生产免疫毒素(2)用于肿瘤的影像分析和治疗

7.噬菌体抗体库技术的基本原理:用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗

体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。

7.噬菌体抗体库构建过程

(1)从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；

(2)应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段；

(3)构建噬菌体载体；(4)用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。

通过多轮的抗原亲和吸附（结合）-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。其中，噬

菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤。

减毒活疫苗的优缺点：

优点：

（1）通过自然感染途径接种，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫在内的更全面的免疫应答，使机体获得更广泛的免疫保护；（2）由于使用的是活的微生物他们可以在体内

长时间起作用而诱导较强的免疫反应，且由于活的微生物有增殖的特性，理论上只需要接

种一次，即可达到满意的免疫效果；（3）可能引起水平传播扩大免疫效果，增强群体免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐剂，生产工艺一般不需要浓缩纯化，价格低廉。

缺点：

(1)一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病，并

且由于种种原因如基因修饰等，减毒活疫苗可能出现毒力回复即“返祖”现象；(2)减毒活

疫苗是活的微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传

染源；(3)缺损颗粒可能干扰免疫效果，因此产品分析评估较为困难；(4)保存运输等条件要

求较高，如需冷藏等。

1.灭活疫苗的特点：(1)灭活疫苗常需多次接种；(2)接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时

间而下降；(3)灭活疫苗需要量大。

第七章 发酵工程制药

1.发酵类型：(1)微生物菌体发酵(2)微生物的酶(3)微生物的代谢产物发酵(4)微生物转化发

酵(5)生物工程菌发酵

2.微生物发酵生产药物的分类：(1)抗生素类(2)氨基酸类(3)核苷酸类(4)维生素类(5)甾体类

激素(6)多糖类(6)治疗酶及酶抑制剂

3.菌种保藏方法：(1)斜面低温保藏法(2)石蜡油封存法(3)沙土管保藏法(4)麸皮保藏法(5)甘

油悬液保藏法(6)冷东真空干燥保藏法(7)液氮超低温保藏法(8)宿主保藏法

4.种子液具备的条件：(1)菌种的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；(2)

生理状态稳定；(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；(4)无杂菌污染，保证纯种培养；()保持稳定的生产能力

5.微生物的发酵方式：（1）分批发酵（2）补料—分批发酵（3）半连续发酵（4）连续发酵

5.发酵过程的中间分析项目：（1）产物产量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌丝形

态

6.发酵过程的影响因素及控制：（1）菌体浓度的影响及控制（2）营养物质对发酵的影响

及控制（3）温度的影响及控制（4）PH的影响及控制（5）溶氧的影响及控制（6）二氧化碳的影响及控制（7）泡沫的影响及控制（8）染菌对发酵的影响

第2篇：生物制药技术

08药学***3陈省委

组合生物合成药物进展

摘 要50年来抗生素在人类疾病治疗中发挥了重要作用,今后的几十年里它们也将是关键的治疗剂。尽管在过去的20年中通过靶向筛选发现了一些微生物药物,但是这种筛选方法很难发现新类型药物。组合生物合成可以弥补这种不足,通过基因工程方法改造微生物基因和酶,产生新的抗生素,发现那些在自然界中不能发现的药物。

关键词 基因工程合生物合成新抗生素

微生物种类繁多,其产物化学结构丰富多彩,生物活性十分广泛,是开发各种新产品的丰富资源,但是传统的筛选方法已远远不能满足社会发展的需要。随着分子生物学和生物技术的发展,以及基因组学、蛋白质组学、生物信息组学、代谢组学研究的深入,人们对微生物基因组的研究也有了显著进展,已经阐明了许多与微生物代谢有关的生物合成基因,为微生物组合生物合成药物的研究和开发奠定了良好的基础。

一、研究背景

自1928年弗莱明发现青霉素和1942年瓦克斯曼发现链霉素以来,微生物药物在疾病防治和拯救人类生命中起着十分重要和不可替代的作用,特别是抗生素被国外科学家誉为20世纪医学领域的皇冠宝石。微生物药物一直是临床最常用的药物,在西方发达国家,抗生素占临床处方药物的20%以上,在中国约占处方药物的30%。但自上世纪70年代后,随着脊髓灰质炎、天花、麻风等传染性疾病先后在全球范围内被消灭,国家对微生物药物研究的支持逐渐下降,抗传染病药物研究进入了困难时期。上世纪90年代后,我国在已有亿乙肝病毒携带者的基础上,又出现了100万以上人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者。2002年末以来,重急性呼吸窘迫综合征(SARS)的出现使我国的传病控制告急,不得不重新思考微生物药物的研究策略在新的时期里,微生物药物研究再度升温,原因

①新病原微生物不断出现,如SARS、艾滋病(AIDS)疯牛病等;②生物武器的使用,如炭疽等;③各种耐菌株在世界范围的传播;④许多传染性疾病,如肺核、血吸虫病等的死灰复燃。目前国内外侧重研究的生物药物,主要有抗新病原微生物,抗耐药菌,抗病毒,抗肿瘤抗生素以及微生物来源的生理活性物质。微物药物的研究主要

包括以下内容:①抗新病原微生药物的寻找与开发;②细菌耐药机制及其抗耐药细药物研究;③微生物药物的生物合成基因研究;④组生物合成微生物药物研究。其中组合生物合成微生药物是近年发展较快的研究领域,将在创新药物研中发挥重要作用。

二、组合生物合成生物技术,尤其是基因工程技术的不断发展,为生物医药领域开辟了广阔的前景;通过基因工程技术所得到的药物也在临床治疗某些疑难疾病中发挥着越来越重要的作用。

广义,基因工程产品分为两类

①单基因直接产物。通常是指单个基因编码序列的翻译产物(蛋白质),它们一般是生物大分子如干扰素和单克隆抗体,目前生物医药领域中开发的多数产品均属于此类,其中包含有效地用于临床治疗的如重组人胰岛素、干扰素和促红细胞生成素。我国在此领域独创的药物不多,而且这类药物的一个突出缺点是它们比较容易被仿制,只要有了相应的细胞系即可利用基本设备进行生产。

②多基因间接产物。是指由多基因编码的多酶体系介导而合成的小分子化合物和多肽,包括自然界由微生物和植物产生的天然产物,如抗生素、生理活性物质或萜类化合物等结构比较复杂的化合物。它们品种繁多,性能各异,仅就目前研究得比较深入的聚酮体和萜类化合物,就包括具有抗肿瘤作用的阿霉素、紫杉醇,具有免疫抑制作用的FK50

6、西莫罗司,具有降血酯作用的洛伐他汀、银杏内酯,具有抗结核杆菌作用的利福霉素,抗疟药物青蒿素等。

组合生物合成(combinatorial biosynthesis)是在微生物次级代谢产物合成基因和酶学研究基础上形成的。组合生物合成的概念是结构不同但生物合成途径相似的抗生素生物合成基因之间可以进行重组、组合或互补产生新结构的化合物。尽管微生物药物的结构多样,但形成这些产物的主要生化反应机制却基本相同,它们通常是由非常简单的化学物质,如小分子羧酸和某些氨基酸作为合成起始单位和延伸单位,通过由一系列基因编码的多酶体系参与的生物化学反应(构成一个合成途径)而形成的,参与这些天然产物生物合成的多酶体系是由多个结构明显分开的功能区域所组成。研究表明,参与这类小分子生物合成的基因通常是连锁或邻接而构成一个基因簇(cluster),这为基因的克隆和操作提供了方便,同时由于参与

次级代谢生物合成酶系对底物的特异性,专一性要求不是很严格的,对结构相类似的底物均可识别,这一特点为不同基因组合产生新的化合物创造了条件。因此,有针对性地对某些基因进行操作,如替换、阻断、重组以及添加、减少组件等,均有可能改变其生物合成途径而产生新的代谢旁路(metabolic pathway),继而形成新的化合物,这就为组合生物合成提供了基础,国际上已有通过这些手段得到多个化合物的报道。

三、研究的科学意义

开展微生物基因工程组合生物合成创制新型药物研究,具有如下意义。

1、利用组合生物合成体系,完成化学方法不能完或难以完成的活性化合物的合成,如抗癌药物紫杉(taxol)等;这类活性化合物在自然界中含量少、需要大、医学价值高,而且通常化学合成困难(成本高,难大,环境污染严重),为了确保红豆杉资源的可持续用,除正在开展的苗圃栽培,并以苗圃作为紫杉醇提的原料之外,通过生物合成来使它们具最终的商业值是一个极具潜力的手段。例如,与抗癌药物紫杉醇用相似的埃波霉素(epothilone)已在链霉菌中通过合生物合成方法获得表达,现已进入开发研究阶段。

2、对一些现有的结构复杂的天然产物如青蒿素银杏内酯等有效组分进行定向合成,对临床用抗生品种进行有针对性的修饰和改造,如对红霉素进行造产生酮内酯型的大环内酯类抗生素,获得对临床药菌具有活性的抗生素衍生物;或者通过对现有天产物或抗生素的结构改造,获得具有全新活性的或化性能有明显改善的天然产物或新抗生素。

3、组合生物合成产生新化合物的潜力很大,化合数是以可操作基因的指数方式形成,如设R为可利的基因数,n是每个基因的不同等位形式(即不同天产物来源的数目),从理论上讲经过基因组合可得Rn种排列组合,即得到Rn个化合物。通过组合生合成,获得一大批新化合物,作为高通量药物筛选样库的来源之一。

4、由于多基因组合操作的平台是以易于大规模产的微生物体系为基础,使创制新型药物的研究便产业化。

5、组合生物合成的研究,必将推动我国在基因水对天然资源的利用,更好地利用植物代谢产物,挖掘前实验室条件下无法进行培养的生物体,包括海洋的生物体。随着研究和应用的发展,植物和海洋生物级代谢产物的组合生物学研究,也将蓬勃

发展起来。

四、国内外研究现状

1985年,Hopwood教授[4]在世界首次报道用遗工程的手段合成“非天然”的天然产物isochromanequinone,该工作为后来的组合生物合成奠定了础。在以后的十几年里,这一领域成为天然产物代工程研究中最活跃的领域,许多微生物次级代谢研的专家都加入这一领域的工作,因为组合生物合成潜力制造出很多先导化合物。目前的发展趋势由最初的基础研究逐步演变为基础与应用兼顾,有的地向产业化迈进。该领域的研究也同样得到工界的重视,美国加州高新技术产业公司研制的埃波素(epothilone D)已进入III期临床评价阶段。埃霉素原来由纤维堆囊黏细菌产生,其产量低,繁殖时间长,产品无法进行产业化生产。该公司利用基因组合技术使纤维堆囊黏细菌的埃波霉素生物合成基因在链霉菌中得到表达,并通过酰基转移酶域替换及羟基化酶基因的阻断,获得了主要产生埃波霉素中抗肿瘤活性最好组分的epothilone D的基因工程菌。我国自上世纪80年代初开展以多基因组合工程技术研制新药的研究,在聚酮类抗生素如大环内酯类抗生素、利福霉素、安莎霉素及抗生素产生菌分子生物学研究方面,取得一定进展。国家重大专项支持的基因工程必特螺旋霉素己进入临床研究,基因工程必特螺旋霉素的研制为组合生物合成技术应用于小分子化合物的创制中提供了良好的工作基础和经验。我国微生物代谢产品研究历史悠久,已形成多学科协调合作的体系,近年来在国家的支持下该体系已得到一定的发展,加强了微生物及代谢产物资源的开发。我们已逐步建立难培养极端微生物和未培养微生物资源及海洋微生物的挖掘工作,建立并完善从土壤或其他来源直接分离DNA技术。我国有很强的有机化学合成能力,可以合成进行组合合成的起始单元,开展前体介导的组合生物合成(precursor-directed biosynthesis)研究。我们已建立并不断完善多种生物活性筛选模型,有天然产物化学分离鉴定及药理、药效、毒理评估的配套学科。

目前基因工程技术的发展水平,在单基因操作方面已经比较成熟;在多基因操作层次上虽然技术难度相对比较大,但近年来在此研究领域已有了迅猛的发展,已积累了较好的研究基础,许多次级代谢产物生物合成基因簇已得到克隆,基因结构与功能已得到阐明,并且发展了一系列大容量载体和合适的宿主表达系统。组合生物合成已形成国际药物领域研究的热点和一个重要发展方向。

五、研究方向与前景

我国天然微生物及植物资源丰富,以微生物作为平台的药物生产历史悠久、种类繁多,利用这一宝库开展组合生物合成研究,建立新型化合物库,作为新型药物或先导化合物的重要来源之一,有重要的理论与实际意义。组合生物合成为当今世界研究热点,我国也有一定工作基础,开展这方面的研究将有利于加深对次级代谢生物合成机理的研究与应用、促进生物技术新药研制中的作用,对发展我国新药有重要意义,并推动新药研究中高通量筛选技术与方法的建立与善,筛选出有价值的新药。

我们要重点加强难培养微生物及海洋生物资源挖掘工作,建立并完善从土壤或其他来源直接分DNA技术,以丰富组合生物合成基因资源;加强微物天然化学研究,建立微量、快速、高效鉴定天然产化学结构的技术和方法;充分利用我们已经建立的种生物活性筛选模型,通过广泛地联合与协作,扩展合生物合成技术在创新药物中的应用,建立我国基工程微生物组合生物合成创制新型药物或先导化合研究的技术平台。该研究将有助于开拓和促进我国新技术在新药研究与开发中的应用,对创制具有我自主知识产权的新药将会有积极推动作用。

对本课程的意见：

1、可能是因为选课人太少的问题，上课的时候没有很好的听课气氛，不过主要

还可能是自己的原因，自己不能集中精神听讲。

2、以后只要选课的人比较多了，应该会好一些，上课的人少了，总是觉得就像

这门课不重要，老师讲的很清晰，主要是我们上课时常开小差。自从上了大学，就没太有人管了，有时听起课来就爱听不听，这倒是对每门课都差不多的。

3、课堂上可以稍微提问一下，因为提问往往可以引起同学们的注意，这样走神的情况可能会少一些。

4、课堂中还可以穿插一些与课程有关的历史、说一下那些地方比较适合做研究、考研究生去哪里比较好啊什么的，这样既可以对现在的科研大环境有所了解，课堂内容也不至于太单调。

最后谢谢老师兢兢业业地为我们把课上完，尽管上课人数少，你还是把课完整地给我们讲完，谢谢老师为我们的付出。

第3篇：生物制药技术

酶

分离纯化酶的一般程序

1粗酶液的制备：材料的选择，发酵液处理，细胞破碎及酶的抽提 2酶的初步分离：盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，离心分离 3酶的高度纯化（酶的精制）：层析法（凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析及亲和层析），电泳（等电聚焦电泳）

4浓缩干燥及结晶：透析，旋转蒸发，超滤，冷冻干燥

酶的主要纯化技术－层析技术

利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数)，使各组分以不同的比例分布在两相中，当流动相以一定的速度流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离的技术过程。称为层析技术（chromatography）

离子交换层析（ion exchange chromatography）

在一定的pH条件下，带电荷的蛋白质与高分子不溶性固定相偶联的离子交换基团相吸附，流动相中解离的离子与被吸附的酶发生可逆的交换，而对不同吸附能力的蛋白质进行分离 离子交换剂的选择：阴离子交换剂用于处理净电荷为负的蛋白质，阳离子交换剂用于处理净电荷为正的蛋白质

样品在低离子浓度条件下上柱，逐渐增加洗脱液的离子浓度，使蛋白依次被洗脱下来 洗脱方式可以是步进式洗脱或线性梯度洗脱 洗脱液一般用 NaCl

凝胶过滤法（gel filtration）亦称分子筛层析、排阻层析，是利用生物大分子的相对分子质量的差异进行层析分离的一种方法

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；

分离提纯 脱盐 测定高分子物质的相对分子量

疏水层析（hydrophobic chromatography）

原理：蛋白质分子中含有亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等疏水性较强的氨基酸，当蛋白质溶液经过疏水层析介质的疏水配基时，蛋白的疏水性集团（疏水补丁）会与疏水配基发生亲和作用而被吸附在介质上。不同蛋白质分子中疏水基团的数量和特性有所不同。在洗脱时通过改变洗脱液的极性达到分离的目的亲和层析（affinity chromatography）

也称功能层析、生物专一吸附或选择层析。根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的方法 酶与激活剂/抑制剂/底物/辅酶；抗原与抗体；激素/配体与受体；蛋白质与DNA/RNA上特定区域

特定的配基（激活剂/抑制剂/底物/辅酶）固定于惰性载体 目的酶与配基特异性亲和吸附，杂质被洗脱 改变洗脱条件，解除目的酶与配基的专一性结合固定化酶（细胞）的定义

优点：

1.稳定性显著提高；

2.同一批固定化酶能重复多次地使用； 3.固定化后，很容易与反应物分开（过滤），不污 染产物，而且有利于控制生产过程，同时也省去了 热处理等使酶失活的步骤；

4.可长期使用，并可预测衰变的速度； 5.提供了研究酶动力学的良好模型。缺点：

①固定化时，酶活力往往有损失。②增加了生产的成本，初始投资大。

③只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜。④非均相反应。

①注意维持酶的催化活性及专一性。在酶的固定化过程中，酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。②固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。

③固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。④酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。

⑤固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或溶剂发生化学反应。⑥固定化酶成本要低，以利于工业使用。

载体结合法

1物理吸附法2离子结合法3共价结合法 是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。1）物理吸附法 作用方式：非特异性物理吸附作用：范德华力；氢键；疏水作用；静电作用 优点：制作简单，酶分子的构象很少或基本不发生变化，固定化酶活力较高 缺点：酶与载体结合力弱，酶易从载体脱落 载体：纤维素、琼脂糖、活性炭、沸石及硅胶等 2)离子结合法

作用方式：离子键结合优点：制作简单，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以制得活力较高的固定化酶。

缺点：离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应时，酶与载体易分开。载体：多糖类离子交换剂，合成高分子离子交换树脂 3)共价键结合法

作用方式：共价键结合优点：酶分子和载体间的共价键较牢固，有良好的稳定性及重复使用性 缺点：制备过程复杂，反应条件比较剧烈，酶活性损失比较严重。

制作方法：先将载体活化，在载体上引入一个活化基团，然后该活化基团再与酶分子表面的基团（羧基/氨基/羟基）反应结合。有戊二醛法、重氮化法、烷基化法等。

交联法

利用双功能（或多功能）基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联，凝集成网状结构而成为固定化酶

常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等。其中最常用的是戊二醛

包埋法

1网格型2微囊型

将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。

载体：凝胶，高分子聚合物（半透膜）

优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化。

缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。所以用包埋法制备的酶，一般只适用与小分子底物。

包埋法分为：网格包埋法和微囊包埋法。

酶传感器（enzyme sensor）1生物传感器的概念

由生物识别物质（如酶、微生物、动植物组织、抗体等）和能量转换器相结合所构成的分析仪器，可以简便快速的测定各种特异性很强的物质 要求识别物质对被测物具有高度的敏感性和选择性

根据识别物质可分为：酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器

2、生物传感器的一般结构与工作原理 结构:有两个部分组成生物分子识别元件（感受器）：酶、核酸、抗体、细胞等 信号转换器（换能器）：电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、表面等离子共振器件等 原理：待测物质经扩散作用进入生物传感器,通过分子识别发生特异的生物化学反应,产生的生化信号经换能器转换为可定量和可处理的电信号,进而可检测出该物质的浓度.根据反应产生的信号不同，可选择相应的换能器.抗体

多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇（antigenic determinant）的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibodies，PcAb）。

单克隆抗体：单一类型的只针对某一抗原决定簇的抗体分子，是由单一的B淋巴细胞克隆产生的结构和特异性完全相同的高纯度抗体。

抗原的制备

1.用基因工程技术制备重组蛋白抗原

2.提取纯化天然抗原

3.合成多肽半抗原

4.小分子半抗原

5.多肽半抗原及小分子半抗原与载体偶联

免疫

动物选择：Balb/c小鼠，品系一致

途径

体内，体外，脾内免疫

筛选阳性克隆及克隆化

克隆：由单个细胞繁殖扩增而形成性状均一的细胞集落的过程。

目的：筛选阳性克隆；确保杂交瘤细胞所分泌的抗体具有单克隆性以及从细胞群中筛选

出具有稳定表现型。

筛选阳性克隆鉴定

单克隆抗体活性检测方法：

1）酶联免疫吸附实验（ELISA）：可溶性抗原、细胞核病毒。2）放免测定（RIA）：可溶性抗原、细胞抗体。3）FAC（荧光激活细胞分选仪，流式培养仪）：针对细胞表面

抗原的抗体检测。

4）IFA（间接免疫荧光法）：用于细胞和病毒抗体的检测。

杂交瘤细胞的克隆化

（1）有限稀释技术 柏松分布（2）半固体琼脂培养法

0.5%琼脂培养基中进行克隆

1ml含不同数量的细胞悬液

1ml42度0.5%的琼脂液

单克隆抗体的大量制备

基因工程抗体（genetically engineered antibodies,gAb）

是通过基因工程技术研制的，即通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。基因工程抗体既保持了单抗的均一性、特异性强的优点，又能克服其为鼠源性的不足，是拓展单抗广泛人体使用的重要途径。

（一）嵌合抗体（chimeric antibody）

特点：是用人抗体的C区替代鼠的C区。效果：使鼠源性单抗的免疫原性明显减弱，并可延长其在体内的半衰期及改善药物的动力学。嵌合抗体的优点：

保持了亲本鼠单抗的特异性和亲和力；

减少人源性的恒定区的HAMA现象；

能有效地介导产生补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）及免疫调理作用。缺点：

目前已有数十种嵌合抗体进入了临床试用，虽然HAMA现象较鼠单抗大为下降，但有相当比例的患者仍会出现HAMA症状，针对可变区的抗独特型抗体反应仍很明显。

（二）改型抗体（reshaped antibody，RAb）亦叫“重构抗体”，“CDR移植抗体（CDR grafting antibody）”。它是利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补性决定区（complementarity determinative region，CDR）的氨基酸序列改换成鼠源单抗CDR 序列。

特点：此种抗体可以使人单抗获得鼠单抗的特异性又保持人源抗体的亲和力。

动物

动物细胞分类

1、贴壁依赖性细胞 概念：anchoraged-dependent cell需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞 大多数动物细胞都属于此类。

2、非贴壁依赖性细胞

概念：anchoraged-independent cell不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中悬浮生长，被称为悬浮细胞。举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞，Namalwa细胞。

3、兼性贴壁细胞

概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。理想的药物生产细胞系

转基因技术的基本原理

将体外构建的重组DNA分子(目的基因或基因组片段)通过显微注射、或转染胚胎干细胞等方法注入动物的受精卵或着床前的胚胎细胞,然后将此受精卵或胚胎再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带外源基因的转基因动物。

同源重组

双链DNA的两个区段的DNA序列基本一致，但不一定完全相同，叫做同源区。同源的双链DNA可以通过相互交换进行重组。

外源DNA如有同源区，也可通过类似的同源重组过程整合到生物的染色体基因组上。

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多潜能细胞系，具有胚胎细胞相似的形态特征和分化特征。

新型

反义技术：根据碱基互补原理，使用与目标靶的遗传物质（DNA或mRNA）特定互补的核苷酸片段来封闭基因表达的技术方法。

反义药物：人工合成或生物合成的DNA或RNA，能与RNA互补，抑制疾病基因的表达。反义核酸（antisense nucleic acid）是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列。它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点。

核酶(ribozyme)具有酶活性的RNA，可降解特异的mRNA序列。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）

由双链RNA介导的细胞内特异性mRNA降解过程，导致靶基因的表达沉默。

基因导入方式

直接体内疗法（in vivo）

是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。间接体内疗法（ex vivo）

是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。

肿瘤的基因治疗

（一）通过抑癌基因抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡。

（二）通过病毒感染杀伤肿瘤细胞

（三）通过诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞

（四）肿瘤的自杀基因治疗

（五）肿瘤抗原靶向的肿瘤基因治疗

（六）细胞因子基因治疗

生物技术制药的教学实践

制药工作总结（共12篇）

制药企业工作总结（共4篇）

生物技术实践

制药公司个人工作总结（共14篇）