项目研究计划书

班 级

本药5班

学 号

2019103010503

题 目

PDTC调节线粒体功能障碍与Klotho蛋白表达大鼠脓毒症合并急性肾损伤的影响

项目的立项依据

填写内容：问题提出、国内外研究现状及发展动态分析、研究意义，附主要参考文献目录。（不少于1000字）

研究现状：脓毒症是重症监护病房中发病率和死亡率较高的常见病状，由感染引起全身炎症反应和组织器官功能障碍，进而危及患者生命。据统计，由脓毒症引起的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的发生率高达50%，并与不良的临床结果密切相关。目前，AKI的发病率呈逐年上升趋势，危重患者比例及病 死率居高不下，AKI后慢性肾脏病( chronic kidney disease，CKD) 进展的风险增加，其中相当一部分患者最终发展为终末期肾病。脂多糖（lipopolysac-charide，LPS）是革兰氏阴性菌的主要外膜成分，是主要的内毒素之一。LPS通过诱导炎症反应、氧化应激和细胞凋亡，在脓毒症相关AKI的发病机制中发挥重要作用。作为参与生物能量代谢的主要细胞器，线粒体功能发生障碍在AKI向CKD进展的过程中起着不可或缺的作用，目前该领域的主要研究方向为靶向调控线粒体生理功能及维持其在生物体内的动态平衡，但迄今为止尚缺乏有效的调控靶点。线粒体作为细胞能量源通过产生ATP推动新陈代谢，狭义上线粒体功能障碍 被定义为线粒体无法产生能量需求所需ATP水平而引起的症状。如今这一概念变得更加宽泛，它包含线粒体DNA损伤，线粒体动力学、形态学异常，底物分解代谢异常及活性氧产生／清除失衡等。脓毒症可引起线粒体损伤和免疫功能紊乱，并且在炎症反应中NO等危险因素均可诱发线粒体功能障碍、氧化应激和细胞凋亡等现象。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrroiidine dithio carbamate，PDTC）是一种稳定的衍生自二硫代氨基甲酸酯的硫醇化合物，可作为抗氧化剂和自由基清除剂发挥多种生物效应。此外，PDTC还参与调控炎症反应。已有研究表明，PDTC对大鼠糖尿病肾脏损伤与大鼠急性肾损伤均具有一定的保护作用。

研究假说：PDTC是否通过抗氧化作用与抑制核因子-κB（NF-κB）活性，PDTC抑制细胞因子模拟可诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达和一氧化氮（NO）合成，破坏肝细胞中STAT激活来抑制IL- 6信号传导，来减弱炎性反应，以达到PDTC可在大鼠脓毒症合并AKI中起到保护作用，改善脓毒症合并AKI的线粒体损伤及功能障碍。

研究意义：目前，脓毒症引起AKI的病理生理机制尚未完全明确，寻找脓毒症诱发AKI的关键致病因子与相关机制，能够为有效预防和诊治该疾病提供新思路。进一步探究线粒体功能障碍与AKI向CKD转变的相关发生机制对以此为靶点治疗干预此病理过程具有重要意义。

主要参考文献：

[1]陈娟,陈拉斯,陈丽,唐文庄,张琼果,王善志.FOXM1通过靶向上调PHB2的转录改善线粒体功能障碍保护脂多糖诱导的肾小管上皮细胞损伤[J].河北医学,2022,28(03):368-374.[2]赵孝杰,王磊,陈志远,刘修恒.线粒体功能障碍在急性肾损伤向慢性肾脏病转变中作用机制的研究进展[J].医学综述,2021,27(22):4374-4378.[3]袁清,刘江华,曾召林.线粒体功能障碍在代谢性炎症中的作用[J].江苏大学学报(医学版),2021,31(05):448-454.DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.y210077.[4]张欣,廖晓辉.线粒体功能障碍在急性肾损伤向慢性肾脏疾病转变中的作用[J].基础医学与临床,2021,41(04):589-592.DOI:10.16352/j.issn.1001-6325.2021.04.022.[5]吴炆晓,张爱华.线粒体功能障碍与脓毒症急性肾损伤的研究进展[J].中华肾脏病杂志,2020(04):327-328-329-330-331.[6]张新杰,刘建坤,高冬梅,等.吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中国病理生理杂志,2012,28(10):1807-1811.[7]唐华,陈蓉,张春梅,等.吡咯烷二硫氨基甲酸对大鼠急性肾损伤的保护作用及机制[J].转化医学杂志,2013,2(3):133-136.

研究内容

包括研究目标、研究内容、研究路线，以及拟解决的关键科学问题。（不少于1000字）

研究目标：已有研究表明，PDTC对大鼠糖尿病肾脏损伤与大鼠急性肾损伤均具有一定的保护作用，而关于其在脓毒症合并AKI中的作用及机制研究较少，本研究通过构建脓毒症AKI大鼠模型，以探究PDTC对脓毒症合并AKI大鼠的作用情况，及其对线粒体功能与抗衰老蛋白Klotho表达的影响。

研究内容：

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康SD大鼠，雄性，体质量180~200 g。饲养于室温（23±2）℃ 、湿度40%～60%的小动物饲养箱内，以12 h光照/黑暗交替循环，期间自由进食、饮水。试验前将大鼠在动物实验中心适应性饲养1周。

1.2主要试剂与材料 PDTC购自美国Sigma公司，ELISA试剂盒和丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所，Masson染色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，苏木精—伊红（HE）染色试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒和免疫组织化学染色试剂盒购自 北京索莱宝科技有限公司，免疫荧光染色试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒和增强型ECL化学发光液购自上海碧云天生物技术研究所，TRIzol试剂、cDNA 合成试剂盒与 SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒购自日本Takara公司，抗体Klotho、细胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）、自噬标记轻链3（LC3）、肾皮质匀浆细胞色素-C（Cyto-C）、抗增殖蛋白（Prohibitin）购自英国Abcam公司，抗体 β-actin、辣根过氧化物酶 标记的山羊抗兔IgG和生物素标记的山羊抗兔IgG 购自美国Santa Cruz公司。其他试剂均为国产市售分析纯。

1.3方法

1.3.1 动物分组与处理60只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、PDTC组，每组20只。模型组和PDTC组大鼠通过盲肠结扎穿刺（CLP）制备脓毒症合并AKI模型，造模前大鼠12 h禁食，6 h禁水，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，后固定，剔除腹部体毛，消毒后沿腹部正中间白线切开皮肤2cm左右切口，暴露腹腔脏器，分离盲肠，在距盲端1cm处进行结扎，结扎后逐层缝合切口，并立 即在大鼠股部皮下注射生理盐水。造模成功标准：在CLP模型构建后6h内未出现死亡，并出现包括腹泻、竖毛、萎靡、活动力减弱等脓毒症的标准症状。对照组大鼠除了不进行盲肠结扎穿孔和不留置导管外，其他操作均与上述过程相同。PDTC 组大 鼠在造模后1h，以50 mg/kg 剂量通过腹腔注射PDTC试剂液，模型组及对照组注射同等剂量生理盐水，每日1次，持续1周。

技术路线：采取ELISA法检测血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）和24 h尿蛋白（24 h UP）水平；采取肾组织氧化应激指标检测；采取HE染色观察肾组织病理形态学变化；采取Masson 染色观察肾组织胶原沉积；采取TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡；采取免疫组织化学染色检测肾组织Klotho蛋白表达；采取实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）检测肾组织Klotho mRNA 表达；采取免疫荧光染色检测肾组织LC3与COX Ⅳ表达；采取Western blotting法检测肾组织Cyto-C、Prohibitin蛋白表达；采用SPSS 23.0软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间数据比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

拟解决的关键科学问题：PDTC作用下是如何对该疾病造成的影响，及其如何确定与线粒体功能障碍的关联和调控的分子靶点；PDTC具有广泛生物学和病理学作用，在调节炎症信号通路中可将其作为针对多种炎症疾病的有效治疗方法来开展相关研究；PDTC作用过程中是否涉及其他靶点与机制还有待进一步研究；PDTC是如何对脓毒症合并AKI大鼠的作用的，及其如何对线粒体功能与抗衰老蛋白 Klotho 表达的造成影响；PDTC在脓毒症合并AKI中的作用及机制。

成绩（百分制）：