分离实验三
1、了解双水相系统形成的机理及常用的双水相系统。
2、掌握双水相系统中相比的测定方法。
3、巩固离心机的操作方法及注意事项。
双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成,与一般分离纯化技术相比,双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。
常用的双水相系统有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。分成两相后，上下相体积比称为相比，相比增加，上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶在两相中的分配系数，使酶富集于上相。
（NH 4）2 SO 4 固体、PEG400 液体、PEG4000 固体、糖化酶滤液（浓度为 5%~10%）均可）、、蒸馏水、带刻度离心管、电子天平（或台秤）、台式离心机等 上相。
三、实验试剂和器材：
（NH 4）2 SO 4 固体、PEG400 液体、PEG4000 固体、糖化酶滤液（浓度为 5%~10%、均可）、蒸馏水、带刻度离心管、电子天平（或台秤）、台式离心机等 四、实验步骤：
1、在四只 10ml 刻度离心管中，用电子天平准确称取 以下 药品 到每个离心管中。
（（1）（NH4）2 SO4 固体 1.30g，PEG400 液体 2.00g（（2）（NH4）2 SO4 固体 1.30g，PEG4000 固体 2.00g（（3）（NH4）2 SO4 固体 1.50g，PEG400 液体 1.80g（（4）（NH4）2 SO4 固体 1.10g，PEG4000 固体 2.20g 把 先把 PEG4000 固体称好后碾碎再加到离心管中，这样比较好溶解。
2、然后再用移液管分别在上述四只 离心管 中 各 加入 糖化酶上清液 0.5ml（（似近似0.5 g）），然后加水(约 约 4.2 g)，为 到总量为 8.00g。
3、旋紧试管口，用力振摇数分钟，使（NH 4）2 SO 4 或 PEG4000 固体完全溶解，并使两相充分混合，以使酶在两相中的分配达到平衡。
4、用台式离心机 3000 转/分钟离心分离 10 min 后，应观察到明显两相。（注意离心前对角线上的离心管一定要先平衡，若不平衡，可在套管中滴加少量水；再者，离心机转速在启动前打到零挡，启动后再慢慢加速到 3000 转/分钟，离心机停止转动前不能打开离心机的盖子）。
5、分别读出上、下相体积，并求出四个相体积比 R 值（即 R1、R2、R3、R4）。
四只离心管的上下相糖化酶的含量的测定，由实验四来完成。
四个双水相系统萃取糖化酶达到平衡后的相体积比 1 号 2 号 3 号 4 号 上相 4.3 2.7 3.6 3.2 下相 2.1 3.5 2.5 3.3 体积比 2.05 0.77 1.44 0.97 分析高聚物的分子量及成相聚合物和盐的浓度对相比的影响。
答：①从 1、2 号管可以看出，高聚物的分子量越小，上下相的体积比越大，由实验四结果可以知道分子量越小，糖化酶在上相的量越多。
②由 1、3 号管对比，总浓度一定，PEG 浓度高、盐浓度低时相体积比更大。
双水相系统的主要应用 答：用以进行从粗制细胞浓缩物或其他混合物中萃取蛋白质或酶以及其他易变性生物分子的操作。
