细胞实验全集
细胞生物学 添加时间：2008.10.28 | 作者：admin 实验一 普通光学显微镜与特殊显微镜的使用 一、实验目的 1.强化普通光镜结构和使用技能的知识，掌握让其发挥最佳效能的方法。
2.了解相差显微镜、荧光显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。
二、实验原理（一）普通光学显微镜 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、光学部分和照明部分。
1.机械部分：（1）镜座。（2）镜柱。（3）镜臂。（4）镜筒。（5）物镜转换器(旋转器)。（6）镜台(载物台)。（7）调节器：①粗调节器(粗螺旋)，②细调节器(细螺旋)。
2.照明部分：包括反光镜，集光器和光圈。
3.光学部分：（1）目镜，（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有 3－4 个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。
在物镜上，还有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表：
物镜 镜口率(N.A.)工作距离(mm)10× 0.28 5.40 40× 0.65 0.39 100× 1.30 0.11 表中的工作距离是指显微镜处于工作状态(物象调节清楚)时物镜的下表面与盖玻片(盖玻片的厚度一般为 0.17mm)上表面之间的距离，物镜的放大倍数愈大，它的工作距离愈小。
显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为 10×，目镜为 10×，其放大倍数就为 10×10=100。
（二）相差显微镜 人类的眼睛只能在光波的波长和振幅有差异时才能识别被检物体。波长决定颜色、振幅决定明暗。在镜检的标本中，经固定、染色的标本就具有上述两种差异称振幅差标本，振幅差标本用普通光学显微镜就可以看得清楚；另一类标本没有明显的波长和振幅的差异，但其各部分却有厚度、折射率的不同，因而具有一定的相位差，称为相位差标本，如活细胞就属于这类标本。相位差标本用普通显微镜看不清楚。1953 年荷兰物理学家塞尔尼克发明了相差显微镜。解决了活细胞直接观察的难题。
1.相差显微镜主要部件：
（1）相差聚光器：普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔，按需要调转使用。
（2）相差物镜：相差物镜是相差显微镜特有的重要装置。在相差物镜内的后焦面上装有种类不同的相板。相板由于前述的作用，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两大类：即明反差（B）或负反差（N）物镜和暗反差（D）或正反差（P）物镜。物镜的反差类别，用英文字母 B 或 N 和 D 或 P 标志在物镜外壳上，并兼有高（H，High）、中（M，Medium）和低（L，Low）等三种不同反应。
（3）合轴调节望远镜：是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。
由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
（4）绿色滤色镜：由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，在光路上加透射光线波长为 500－600nm 左右的绿色滤色镜，使照明光线中的红光和蓝光被吸收。只放过绿光，可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用，以利于活体观察。
2.相差显微镜的成像原理 相差显微镜用较强的光作为光源，来自光源的直射光到达标本面时，可以发生衍射，衍射光比直射光相位延迟约 1/4λ，直射光通光环状光阑，在物镜后焦面形成光环而衍射光在此不能聚焦。因此，直射光和衍射光在后焦面被分开，相差物镜的后焦面装有相板，相板的共轭区和并协区，分别涂上延迟相位的物质，直射光通过相板共轭区，衍射光通过并协区，如果是共轭区涂上相位延迟的物质，则直射光的相位被延迟 1/4λ，这是直射光与衍射光的相位相同，发生相长干涉，使合成波的振幅比直射光振幅大，这是合成波造成的物像比背景亮，这就是明反差；如果在并协区涂上相位延迟的物质，使衍射光的相位再延迟 1/4λ，则发生相消干涉，合成波比直射光的振幅小，这样物像比背景暗，这叫暗反差。
相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。
（三）荧光显微镜 许多物质能吸收波长较短的光。物质分子吸收光能后由基态跃迁到激发态，当这类分子再回到基态时，把多余的能量以波长较长的光发射出来，这叫荧光现象。荧光显微镜即是利用较短波长的紫外光照射标本，使样品受到激发，产生较长波长的不同颜色的荧光，可用来观察和分析样品中产生荧光的成分和结构、位置，主要观察的荧光有自发荧光、染色荧光、诱发荧光、免疫荧光和酶诱发荧光等。
荧光显微镜的结构主要包括三个部分：光源、激发滤片和压制滤片。这些特殊部件再配上一台适合的显微镜就可以作为荧光显微镜观察了。因此在光路中加入了吸热片和滤色镜，使在生物荧光显微镜中常使用的 350－400nm 范围内波长的紫外线通过。
落射式荧光显微镜的光路 三、实验器材和材料 器材：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、百合花粉、秋葵花粉、装片 四、操作步骤（一）相差显微镜的使用 1.相差显微镜的装置 取下普通显微镜的聚光器，换上带有环状光相的转盘聚光器，并将标示孔指"0"(即明视野);取下普通物镜，装上相差物镜。
2.调焦和调光 用普通低倍物镜在明视野中观察，当发现目标后，把观察的目的物移到视野的中央。观察透明物体时要缩小光栏，当用相差物镜在明视野对好焦点后，换上相应的环状光栏，例如l0X 相差物镜用 l0X 标示孔的光栏，并充分开大孔径光栏。
3.中心调节（合轴调节）拨出目镜，插入中心望远镜，用左手固定其外筒，一边眼看望远镜，一边用右手转动望远镜内筒使其升降，对准焦点后就能看到环状光栏的亮环和相板的黑环。此时可将望远镜固定，微微转动聚光器两侧的调节钮，使两者完全重合。如果亮环和黑环大小一不致，可升降聚光器便之一致，如果升降聚光器仍不能矫正亮环和黑环一致的话，那就是载、盖玻片过厚的缘故。换用不同物镜要同时更换相对应的环状光栏，并重新合轴。
（二）荧光显微镜的使用 1、打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。
2、透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。
3、用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。
4、放置标本片，调焦后即可观察。
使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经 5 分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
五、作业 1.相差聚光器和合轴调节望远镜的作用是什么，相板分为几个区，直射光和衍射光是分别通过哪个区的？ 2.写出暗反差成像的原理。
3.观察以下标本的荧光色，并记录下表 材料 自然色 荧光色 材料 自然色 荧光色 曙红 Y 棉花纤维 咖啡因 百合花粉 金橙 G 秋葵花粉 链霉素 罗丹明 实验二 光镜下细胞大小的测量与计数 一、实验目的 1.学会观察某些细胞形态，掌握显微镜使用方法。
2.掌握测量和计算细胞大小的方法。
3.掌握台尺，目尺的使用方法，知道细胞度量单位。
4.掌握血球计数板的使用方法 二、实验原理（一）显微测微尺 显微测微尺分物镜测微尺和目镜测微尺，目镜测微尺为一块可以放入目镜内的圆形玻片，玻片中央有一长 5-10mm 的刻度尺，分成 50-100 格。每格的实际长度随不同的物镜放大倍数而变化。物镜测微尺为一载玻片中封固一圆形测微尺组成，测微尺的长度为 1-2mm，分成100 或 200 格，每格实际长度 0.01mm。当测量细胞大小时，须在显微镜下用物镜测微尺核实目镜测微尺的每一格长度，然后再用目镜测微尺去测定标本。
换算公式：目尺每格长度（mm）= 物尺的格数/目尺的格数×10 ㎛（二）血球记数板 现在使用的记数板为改良 Neubauer 记数板，由一优质厚玻璃制成，每块记数板分为两个记数室。在记数室两侧各有一条支柱，与记数室高度差是 0.1mm，当一块平整的记数用盖玻
片放到两条支柱上时，盖玻片底面与记数室间形成 0.1m 的缝隙。每个记数室的边长各为3mm，并被精密地划分为 9 个大方格，每个大方格长宽各为 1.0mm，面积为 1mm²，加盖玻片后的容积为 1mm² ☓ 0.1mm=0.1mm³（相当于 0.1 ㎕），所以一个大方格的细胞数×104=细胞数/ml。记数细胞时，记数四个大方格中的细胞数，按下公式计算：
细胞悬液的细胞数/ml=(四个大方格中的细胞总数/4)× 104 三、实验器材、药品 普通光学显微镜，微分尺（目尺和台尺），血球计数板，洋葱内表皮细胞,小鼠脾细胞等。
四、实验步骤（一）在光学显微镜下测量细胞大小：
1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。
2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，用低倍镜观察，调焦至看清镜台测微尺的刻度。
3.小心移动镜台测微尺，同时转动目镜(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，两尺左边的"0"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线。
4.记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按公式计算目镜测微尺每格的长度等于多少 mm。
5.拿开台尺，放上细胞标本片，开始测量，按上述公式计算。
（二）细胞计数（1）准备计数板：用去离子水浸泡并冲洗计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干或晾干。
（2）制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于 104 细胞/ml,若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2min），重悬浮于少量培养液中。
（3）加样：用吸管轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。
（4）计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
（5）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度（4 大格中的每一大格体积为 0.1mm3。1ml=l，0000 大格，因此，1 大格细胞数×104=细胞数／ml）细胞数/毫升原液=（4 大方格细胞数之和/4）×104 注意事项：
（1）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。
（2）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。
（3）镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占 10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于 200 个/10mm2 或多于 500 个/10mm2 时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。
五、作业 1.为什么使用显微测微尺前必须进行标定？ 2.记录下所观察的细胞的大小（3 个）。
3.操作血球记数板应注意什么？ 4.计算所记数的每毫升细胞悬液中的细胞总数。
实验三 细胞组分的化学反应 一、实验目的 1.了解 Feulgen 反应的原理，掌握有关的操作方法。
2.了解 Brachet 反应非原理，掌握有关的操作方法。
3.学习及了解显示多糖的 PAS 反应的操作程序及其作用原理。
二、实验原理 细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。
（一）DNA 的细胞化学－Feulgen 反应 DNA 经弱酸（1mol/LHCl）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与 Schiff 试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有 DNA 的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或 DNA酶处理，抽提去细胞中的 DNA 而得到阴性反应，从而证明了 Feulgen 反应的专一性。
图 Feulgen 反应(二)RNA 的细胞化学－Brachet 反应 甲基绿一派洛宁(methyl green－pyronin)为碱性染料，它能分别与细胞内的 DNA、RNA 结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中 DNA 选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的 RNA 选择结合显示红色。其原因可能是两种染料的混合染液有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易于聚合程度高的 DNA 结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的 RNA 结合呈现红色，但解聚的 DNA 也能和派洛宁结合呈现红色。即 RNA 对派洛宁亲和力大，被染成红色，而 DNA 对甲基绿亲和力大，被染成蓝绿色。
（三）细胞中多糖的定位－PAS 反应 高碘酸-希夫试剂反应，简称 PAS 反应。主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能打开 C-C 键，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与 Schiff 试剂反应形成紫红色化合物。颜色深浅与糖类的多少有关。
三、实验仪器、材料和试剂 1.仪器、用具：显微镜、恒温水浴箱、烧杯、试剂瓶、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸。
2.材料：洋葱鳞茎、马铃薯 3.试剂：
（1）1mol/L 盐酸的配制：取 82.5ml 密度 1.19g/ml 的浓盐酸加蒸馏水 1000ml。
（2）Schiff 试剂：将碱性品红 0.5g 加入 100ml 沸水，持续煮沸 5 分钟，并随时搅拌，待冷却到 50℃时过滤到棕色瓶中，加 1N HC1 10 毫升，冷却至 25℃时加入 0.5g 偏重亚硫酸钠，此时需很好的振荡，避光过夜。次日取出(呈淡黄色)加 0.5g 活性炭剧烈振荡 1 分钟。过滤后即得 Schiff 试剂。避光低温保存。
（3）亚硫酸水：取 200ml 自来水，加 10ml 10％偏重亚硫酸钠水溶液和 10ml 1mol/L HCl，三者于使用前混匀。
（4）Unna 试剂：甲基绿-派洛宁染色液 甲液：5％派洛宁水溶液 6ml
2％甲基绿水溶液 6ml 蒸馏水 16ml 乙液：1mol/L 乙酸缓冲液（pH4.8）16ml 甲、乙两液分别置 4℃冰箱备用，用时甲乙两液混匀。
（5）1mol/L 乙酸缓冲液（pH4.8）：A 液冰醋酸 6ml 加蒸馏水至 100ml，B 液乙酸钠 13.5g加蒸馏水至 100ml，取 A 液 40ml 和 B 液 60ml 混匀即可。
（6）高碘酸溶液：
高碘酸 1g 95％乙醇 35ml 1/3mol/L 乙酸钠溶液（2.72g 乙酸钠加 100ml 蒸馏水）5ml 蒸馏水 10ml（7）还原液：
KI 2g 偏重亚硫酸钠 2g 乙醇 60ml 1N 盐酸 1ml 蒸馏水 40ml 四、实验步骤（一）DNA 的细胞化学－Feulgen 反应 1.将洋葱鳞茎内表皮放在 1mol/L HCl 中，加热到 60℃水解 8－10min； 2.蒸馏水水洗； 3.Schiff 试剂染色 30min； 4.用新配制的亚硫酸水溶液洗两次，每次 1min； 5.水洗 2min，将表皮放在载玻片上，加一滴 45％HAc 于载玻片上，加上盖玻片，镜下观察。在显微镜下可观察到含有 DNA 的部位呈现紫红色。
(二)RNA 的细胞化学－Brachet 反应 1.用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上； 2.滴一滴 Unna 试剂，染色 30min； 3.用蒸馏水洗一次，加上盖玻片，用滤纸吸干多余的水分，镜下观察。在显微镜下可观察到含有 DNA 的部位染成绿色或蓝绿色，含有大量 RNA 的核仁呈红色，含有 RNA 的细胞质呈淡红色。
（三）细胞中多糖的定位－PAS 反应 1.把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片，浸入高碘酸溶液 10min； 2.用 70％乙醇中浸片刻； 3.Schiff 试剂染色 20-25min； 4.取出放入还原液 1min，然后用 70％乙醇冲洗一次； 5.将薄片放在载玻片上，加上盖玻片，镜下观察。
五、作业 1.简述 Feulgen 反应、Brachet 反应和 PAS 反应的原理。
2.绘制 Feulgen 反应、Brachet 反应和 PAS 反应的结果。
实验四 植物细胞骨架的光学显微镜观察 一、实验目的 了解细胞骨架的结构特征及其制备技术。
二、实验原理
细胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用。当用适当浓度的 Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝 R250 染色后，可在光学显微镜下观察到由微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。
三、实验器材、药品 材料：洋葱鳞茎。
器材：普通光学显微镜、滴瓶、容量瓶、试剂瓶、烧杯、载玻片、盖玻片、镊子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸。
药品：
（1）M 缓冲液（加水定容到 1000ml）试剂名称 终浓度 每升加量 咪唑 50mmol/L 3.4g 氯化钾 50mmol/L 3.73g 氯化镁 0.5mmol/L 0.1g EGTA 1mmol/L 0.38g EDTA 0.1mmol/L 0.04g 巯基乙醇 1mmol/L 70ul 甘油 4.0mol/L 294.8ml（2）磷酸缓冲液(pH 6.8)：0.2 mol／L 磷酸缓冲液，用 NaHCO3 调至 pH6.8。
（3）1%Trion X-100：用 M 缓冲液配制。
（4）0.2％考马斯亮蓝 R250：其溶剂为甲醇 46.5ml，冰醋酸 7ml，蒸馏水 46.5ml。
（5）3%戊二醛：用 0.2 mol／L 磷酸缓冲液配。
四、实验步骤 1.取洋葱鳞茎切成大小约 0.5cm2 的块状，置磷酸缓冲液内浸泡 3－10 小时； 2.将浸泡后的鳞茎小块移动到 1％的 Trion X-100 中处理 30min； 3.用 M-缓冲液洗 3 次，每次 5 分钟； 4.放入 3％戊二醛中固定 30 分钟； 5.磷酸缓冲液洗 3 次，每次 2min； 6.考马斯亮蓝染色 30 分钟； 7.水洗、铺展、装片、镜检。
五、作业 1.请说出 M-缓冲液各成分的作用。
2.绘制出实验观察结果并阐述实验原理。
实验五 细胞、细胞器及组分的分离与观察 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的 了解叶绿体分离的一般原理和方法,并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。
二、实验原理 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器,能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体,其分离在等渗溶液（0.35mol/L 氯化钠或 0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行,目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在 1000r/min 离心,去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞,然后,3000r/ min 离心,可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温
下进行分离要迅速。
三、实验用品 材料：菠菜叶片 试剂：蒸馏水,0.35mol/L 氯化钠溶液,0.01%吖啶橙 仪器：普通离心机,研钵,天平,荧光显微镜,载玻片,盖玻片,镊子,恒温箱,培养皿,滤纸,试管,试管架,移液管,滴管,烧杯,离心管 四、实验步骤 1.选取新鲜的菠菜嫩叶,洗擦干后去除叶梗及粗脉,称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置组织捣碎机或研钵中。
2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆,3-5min,或研磨成匀浆。
3.用 6 层纱布过滤,滤液盛于烧杯中。
4.取滤液 4mL 在 1000r/min 下离心 2min,弃去沉淀。
5.将上清液在 3000r/min 下离心 5min,弃去上清液,沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
6.沉淀用 0.35mol/L 氯化钠溶液悬浮。
7.取叶绿体悬液 1 滴置于载玻片上,加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时,将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上,再滴加 1 滴 0.01%吖啶橙荧光染料,盖上无荧光的盖玻片后即可观察。
8.观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。
五、作业 1.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 线粒体和细胞核的制备与观察 一、实验目的 1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
2.掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法 二、实验原理 利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异,可采取分级差速离心的方法,将细胞核与线粒体逐级分离出来（差速离心技术）。
线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆,在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速）,球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间,组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间,就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部,从而分批收集。细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液,它较接近细胞质的分散相,在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2 的条件下,亚细胞组分不容易聚集成团,有利于分离。整个操作过程样品要保持在 0℃-4℃,避免酶失活。
细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据,如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色,从而使线粒体显色,而胞质中的染料被还原成无色。
詹纳斯绿 B 是一种活体染料,能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子,酸性染料的胶粒表面带有阴离子,而被染部分本身具有阳离子或阴离子,这样,它们彼此之间发生吸引作用,染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性,而不影响细胞的生命活动和产生任何物
理、化学变化以引致细胞的死亡。
Gimesa 是一种复合染料,即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。
三、实验用品 材料：
鼠肝脏, 猪肝脏 试剂：
(1)0.25mol/L 蔗糖-0.01mol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液 10ml 0.1mol/L 盐酸 8.4ml 加双蒸水到 100ml,再加蔗糖使浓度为 0.2mol/L(2)0.34mol/L 蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）,配法同上。
(3)1%詹纳斯绿 B(Janus green B)染液,称取 50mg（pH7.4）,詹纳斯绿 B 溶于 5ml 生理盐水中,稍微加热使之溶解后,过滤,即为 1%原液。
(4)姬姆萨染液（Giemsa）：称取姬姆萨粉 0.5g,甘油 33 ml、纯甲醇 33ml。先在姬姆萨粉中添加少量甘油,然后在研钵内研磨至无颗粒状,再将剩余甘油倒入混匀,56℃左右保温 2h 使其充分溶解,最后加甲醇混匀,成为姬姆萨原液,保存于棕色瓶。使用时吸出少量,用 1/5mol/L 磷酸缓冲液作 10-20 倍稀释。
(5)1/15 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.8）：1/15 mol/ L 磷酸二氢钾 50 ml,1/15 mol/ L 磷酸氢二钠50 ml(6)卡诺（Cornay）固定液：无水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml(7)生理盐水 仪器：解剖刀,剪刀,漏斗,玻璃匀浆器,尼龙织物,刻度离心管,显微镜,冷冻高速离心机。
四、实验步骤 1.制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹 12 小时,击头处死,剖腹取肝,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干水,称取肝组织 1 g,剪碎；用预冷的 0.25mol/L 蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加 9 ml 预冷的 0.25mol/L 蔗糖溶液的量,分数次添加蔗糖溶液,在 0℃-4℃冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆,肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制一张涂片①,自然干燥)。
2.差速离心：将 0.34 mol/ L 蔗糖溶液 4.5 ml 放入离心管,然后沿管壁小心地加入 4.5 ml 鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。
3.分离物鉴定：
（1）细胞核：将干燥后的三张涂片加入 Carnoy 固定液 15min,晾干。Giemsa 染液染 10min,蒸馏水漂洗数秒,用滤纸吸干水,用显微镜（40×）检查,细胞核呈紫红色,混杂的细胞质为浅蓝色碎片。
（2）线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上,勿太密。滴加 1%詹纳斯绿溶液染色,10 分钟后用光学显微镜观察,线粒体呈蓝绿色,小棒状或哑铃状。
(涂片过程）注意事项：
1.试验全过程要在 0～4℃进行,如果使用非冷冻控温的离心机一般只宜分离细胞核和线粒体,同时注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组织,缩短匀浆时间。整个分离过程不宜过长。
五、作业 1.线粒体提取分离过程中,为什么要在 0～4℃进行？ 1.要获得高活性的线粒体在线粒体提取,分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？
实验六 人癌细胞染色体制备及观察 一、实验目的 学习人类染色体制备的常规方法，了解人癌细胞染色体及其变异。
二、实验原理 目前大多数癌症都建立了相应的细胞株或细胞系，体外培养的癌细胞多属于连续的周期细胞，可以用来制备染色体。国内外制备动物和人类染色体的常规方法是空气干燥法，该方法的关键包括：
1.秋水仙素的预处理：秋水仙素又叫秋水仙碱，它是从植物中提取的一种生物碱，秋水仙素对细胞的作用主要有两个方面，一是阻挠微管的聚合、破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂，从而积累大量中期分裂相；二是使染色体收缩成一定的形状。
2.低渗：用渗透压很低的盐溶液或蒸馏水处理活细胞，使细胞胀大而不破裂，使最后制成的片子染色体充分散开。
3.滴片、干燥：相对于过去制备染色体的切片法和压片法的一种方法，首先制备细胞悬液，然后将悬液滴在载玻片上使细胞和染色体分散并紧贴在载玻片上，经自然风干或风机吹干，即可供染色检查。
三、实验器材、药品 实验材料：Hela 细胞或白血病 K562 细胞。
器材：离心机、普通光学显微镜、10ml 离心管、吸管、酒精灯、载玻片、吸水纸、擦镜纸。
药品：
（1）Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）（2）0.1％秋水仙素溶液：取 10mg 秋水仙素，加入 10ml0.65％生理盐水。
（3）0.075M KCl（4）Giemsa 染液 Giemsa 粉剂 0.5g 甘油 33ml 甲醇 33ml 先将少量甘油加入研钵中，将 Giemsa 粉充分研细，再倒入剩余甘油，并在 56℃温箱中保温2 小时，然后再加入甲醇混匀，储存在棕色瓶内。
（5）pH 6.5 的磷酸缓冲液。
四、实验步骤 1.收集生长旺盛的细胞，吹打散，加入秋水仙素使终浓度达到 1ug/ml 进行预处理； 2.经预处理 6－8 小时后，以 800rpm 离心 7min，去上清； 3.加入 1ml 0.075M KCl 溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加 7ml KCl 溶液，室温下低渗 20min； 4.加入 3－4 滴 Carnoy 固定液后 800rpm 离心 7min，去上清； 5.沿管壁慢慢加入 3ml 固定液，2min 后用吸管轻轻的吹打，使细胞分散，固定 10min 后，离心去上清； 6.加新配的固定液 3ml 吹打均匀，固定 10min，800rpm 离心去上清； 7.重复第六步； 8.去上清后剩 0.2－0.5ml 固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液； 9.吸了细胞悬液滴于冰冷的载玻片上（经 80％乙醇浸泡，0－4℃冰箱冷藏），吹散，过火 5s左右； 10.风机吹干，置于装有 Giemsa 染液的染色缸内，染色 20min，水洗后吹干，镜检。
五、作业
1.在制片中如低渗不足或低渗过度会出现什么问题？ 2.那些因素会影响制片中染色体的分散？ 3.绘制你所观察到的结果。
实验七 显微摄影技术 一、实验目的 了解生物显微摄影的基本原理和装置，以及照相暗室工作的基本过程。
二、实验原理 显微摄影是通过摄影装置拍摄显微镜视野中物体影像的过程，它是必备的一项常用显微技术。它的基本原理是将标本的图像，通过显微镜投射到感光材料（胶卷）上而成为永久性记录。
三、实验仪器、材料和试剂 材料和标本：人类染色体标本，其它染色的生物标本片。
器材和仪器：显微镜、35 毫米照像机、显微照明装置、自动曝光控制器、ASAl00 黑白 135胶卷、洗印和放大等成套的暗室设备。
试剂：D 一 72 式普通显影液、SB-1 式停影剂、F 一 5 酸性定影液。
四、实验步骤(一)拍摄前准备 1．光路合轴 使光轴与光束处于同一轴线上。
2．柯勒氏照明 使观察的视野获碍均匀而又充分的照明；防止杂散光对照相系统产生影响；使被摄物体不受热，影象清晰。
3．物镜与目镜合理组合 依标本的不同和显微摄影要求，物镜与目镜的组合有一定规范，如：拍摄人类染色体影像，采用高分辨率的 100 倍油镜，配合 10 倍目镜，可获得良好分辨的理想放大影像。
4．调整视场光阑和孔径光阑 使两者与所用物镜的数值孔径(N．A．镜口率)相等，所得的分辨力最高；视场光阑一旦调好，不要再动，而孔径光阑可随物镜数值孔径的更换，做相应的调整。一般来说，把孔径光阑的大小调成等于相应该物镜孔径像的 2／3 为宜，尽管丧失了少许的分辨力，却能提高影像的反差、焦点深度和清晰度。
总之，上述作法是调整显微镜至最佳状态。
(二)拍摄程序 拍摄是显微摄影系列操作中的关键环节，在镜检观察中，发现需要摄下的影像应即时拍照。
1．开启相机后盖，安装胶卷于照相机内。
2．打开显微镜照明装置的电源开关，将亮度调至适当。
3．依个人的视力，调整摄影目镜调焦环至“井”字线清晰。
4．放一片需要拍摄的标本载玻片于载物台上。在低倍镜下选好要拍摄的核型或细胞结构，再转换到油镜下，聚焦标本细节，准备拍照。
5．按下曝光按钮，曝光按钮亮表示曝光开始进行，熄灭表示曝光完毕。
6．按下列项目进行拍摄记录：
编号_______________单 位_______________ 课题_______________负责人_______________ 倍数_______________条 件_______________ 日期_______________显微镜型号_______________(三)黑白胶片的冲印 感光胶片在拍摄完毕后，需尽快在暗室中冲洗和晒印，其方法和普通照像相似。其基本
原理是显影液使胶片已感光的银盐潜影还原为可见的金属银影像；停影液使显影液失去显影能力，防止显影过度与斑痕出现；定影液把未被还原的卤化银溶去，晾干是便于胶片和相纸保存。
1．冲印的操作步骤(1)把胶片装入显影罐中(切勿粘在一起)先用清水冲洗，排除气泡．然后再把水倒掉，这有利于显影液的快速均一作用。
(2)从顶部罐口注入预先配好的约 250ml D-72 式显影液。20℃显影 4～12 分钟。
(3)显影中轻轻摇影罐，使胶片表面充分受显影液作用，显影完毕，迅速倒出显影液。
(4)立即注入 250ml 预先配好的 SB—I 式停影液，停显时间为 10 秒，倒出停影液，随之加入 250ml 的 F 一 5 式酸性坚膜定影液，20℃定影 15 分钟。取出胶片流水冲洗 30 分钟以上。
(5)将胶片挂起，用脱脂棉轻轻吸掉胶片表面过多的积水，晾干。
(6)晾干后用放大机的胶片夹子夹住胶片，药膜面朝下，聚焦取景，然后在红灯条件下，用压纸板压住所需号放大像纸，药膜面向上．进行曝光(适当的曝光时间要经试验后决定)。
(7)曝光后的像纸，浸入 D-72 显影液中，然后用竹镊子不时地夹住像纸翻动，直到显影适度为止。
(8)显影合适后立即移到 SB-I 式停影液中，漂洗 10～20 秒，再浸入定影液中处理 15 分钟，取出在流水中冲洗 60 分钟左右。
(9)水洗后，放在电热上光机上烘干；裁边，装入有说明的纸袋内保存。
五、作业 在细胞显微摄影中，欲拍出标本结构细节清晰，层次分明，反差适中的照片，应注意哪些因素? 实验八 动物细胞的诱导凋亡 一、实验目的 了解细胞凋亡的诱导和检测方法，加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。
二、实验原理 凋亡是不同于坏死的一种细胞死亡形式。凋亡的定义最初是建立在形态学评价基础上的，用以区分发生了生理性死亡的细胞与发生坏死的细胞。凋亡期间，线粒体通常保持完整，而细胞核发生染色质凝聚和边缘化，随后断裂，细胞收缩，与相邻的细胞分离，细胞膜出现气泡。最后整个细胞如同出芽般，产生大小及结构都不同的凋亡体。尽管这些形态学变化并非出现于所有类型的凋亡细胞中，但是仍较多见。而细胞坏死的形态学特点，可包括线粒体膨胀，细胞核絮凝，细胞膜破裂等现象，在体内，坏死通常由炎症和组织损伤引起。
凋亡的特征之一，还包括基因组断裂为 180－200bp 的寡核小体片断，此现象可通过电泳检测观察，该技术能提供细胞死亡的定性分析。虽然一些细胞类型或细胞系并不依据这种方式进行核小体间 DNA 连丝的断裂，但目前依然可作为判断细胞凋亡的标准之一。常用的凋亡检测方法一般以细胞内发生的生理、生化变化为检测基础，包括染色法、电子显微术、流式细胞计量分析、膜联蛋白检测、DNA 片断裂解情况的分析、caspase 酶分析等，都具有一定的适用范围。本实验中的吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）染色法，不受细胞类型限制，且简便易行，结果较为可靠（尤其适用于凋亡发生的初期），缺点是样本不能存放，需要立即检测。吖啶橙是一种活性染剂，死细胞与活细胞均能被染色，而溴化乙啶只对失去膜整合特性的细胞染色，对正常活细胞不染色。
三、实验器材、药品 细胞株：Hela 细胞。
器材：荧光显微镜、载玻片、盖玻片、细胞培养瓶、烧杯、试剂瓶等。
试剂：
DMSO 咖啡因（Caffeine）：0.16 mol/l，用沸水溶解。
吖啶橙/溴化乙啶（AO/EB）的 PBS 溶液：PBS 溶液中分别加入 100ug/ml 的 AO 与 100ug/ml的 EB，配成两种溶液，用时再混合。
磷酸盐缓冲液（PBS）：800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，用盐酸调节 pH 到 7.4，加水定容到 1L。高压灭菌保存。
四、实验步骤 1.选两瓶生长旺盛的细胞，细胞达到一定浓度的时候加入终浓度为 16mmol/l 的咖啡因，另一瓶作为阴性对照； 2.第二天取 25ul 的悬浮细胞，加入 1ul 的 AO/EB 混合液，轻微混合； 3.置 10ul 悬浮细胞于载玻片上，加盖玻片，用荧光显微镜观察。活细胞呈现均匀的绿色，凋亡细胞凝聚的染色质呈黄色斑块，而凋亡晚期的细胞为橙色，发生凝聚并通常裂解（坏死细胞也为橙色，但核与染色质不发生凝聚）。
五、作业 简述咖啡因诱导细胞凋亡的原理
