细胞工程,实验一
细胞器的 分离、制备与观察 [ 目的要求] 1．掌握差速离心法的原理。
2．了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。
3.掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法。
[ 实验原理] 球形颗粒的沉降速率取决于其密度、半径、介质黏度和离心力。
差速离心法（differential centrifugation）是将细胞匀浆在密度均一的介质中从低速到高速离心，较大颗粒先在低速离心时沉淀，再用高速离心上清液中的小颗粒物质，从而达到逐级分离细胞器的目的。
细胞器的分离常通过组织细胞匀浆、分级分离和分析三个步骤完成。
分级分离方法有两种，即：差速离心法和密度梯度离心法。
细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和替他微体、核糖体和大分子物质。
线粒体内膜上分布细胞色素氧化酶，能使詹纳斯绿 B 燃料保持在氧化状态呈现蓝绿色，而胞质中的颜料被还原成无色。
[ 实验用品] 1．器具：匀浆器、高速冷冻离心机、天平、普通光学显微镜、1.5 ml Ep 管、载玻片、10 ml 滴管、冰盒、冰块、滤网、染缸、20 ml 烧杯。
2．材料：动物肝脏。
3．试剂：生理盐水、PBS、0.25 mol/L 的蔗糖溶液、0.34 mol/L 的蔗糖溶液、0.88 mol/L 的蔗糖溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰。
4.甲基绿-派洛宁染液：
0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.8)：冰醋酸 1.2ml，加蒸馏水至 100ml；醋酸钠 2.72g 溶于 100ml 蒸馏水中;使用时两液按 2：3 比例混合.A液：5%派洛宁水溶液4ml、2%甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：0.2mol/L。醋酸缓冲液(pH4.8)16 ml。使用时临时将 A 液与 B 液混合(5:2)。
5．）中性红-詹纳斯绿 B 染液：
A: 将 3 滴詹纳斯绿 B 饱和水溶液(溶解度 5.18％)加到 5ml 无水乙醇中，然后再加入 1ml 1:15000 中性红溶液(中性红 10mg 溶于
150ml 水中)，瓶子用黑纸包好，4℃冰箱保存。
[ 实验步骤] 1．组织匀浆制备 肝脏用预冷的生理盐水洗净血污，用滤纸吸干。
称取约 1 g 左右的肝组织，用预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液冲洗数次，剪碎。以预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液 4.5ml 悬浮剪碎的组织，移入匀浆器内，在冰浴条件下匀浆（蔗糖溶液分数次加入）。（0.25 mol/L 的蔗糖溶液使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底）2.细胞器的分级分离 2.1 细胞核的分离：
将组织匀浆分装到 1.5ml 离心管中，3000rpm,离心 10min，沉淀为细胞核及质膜碎片。（上清液留作线粒体分离）2.2沉淀用1ml 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次4000r/min离心10min； 2.3 将沉淀用 500μL 0.34mol/L 蔗糖溶液悬浮，然后在悬液下轻轻加入0.88mol/L 蔗糖溶液 400μL，尽量使溶液分层，5000r/min 离心 15-20min； 2.4 用 PBS 溶液悬浮——涂片——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色 15-20min——放入丙酮分离 30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检。
(2)线粒体的分离 将分离细胞核时收集的上清以 10000g 离心 10 min，弃去上清。沉淀用预冷的 0.25 mol/L 的蔗糖溶液 1ml 重悬后，10000g 离心 10 min，取沉淀。
(3)线粒体的鉴定 于洁净载玻片上滴 1 滴中性红-詹纳斯绿 B 染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色 5-10 min，盖上盖玻片，镜检。
[ 结果与分析] 光学显微镜下观察，可看到富集分离的细胞核，细胞核呈圆球形，核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁，外围的物质被染成蓝绿色；线粒体经詹纳斯绿 B染色呈蓝绿色，呈棒状或哑铃状。
[ 注意事项] 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破碎，又要尽量快速。
2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可能在低温下进行。
3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操作过于剧烈。
[ 思考题] 1． 简述细胞器分级分离的实验原理和主要步骤？ 2．实验操作中有哪些关键步骤和因素影响所得细胞器的含量和纯度？
