细胞工程实验指导
细胞工程实验指导(本科生用)陈 宏 房兴堂 编著 江苏 师范大学 二○ 一三 年 九 月
目 录 第一部分 实验室规章制度 ……………………………………………1 学生实验守则……………………………………………………………1 实验室安全管理制度……………………………………………………1 第二部分 细胞工程基本 实验室 技术 ………………………………3 一、清洗与包装…………………………………………………………3 二、消毒灭菌……………………………………………………………5 三、无菌操作……………………………………………………………9 四、实验室维持…………………………………………………………10 第三部分 实验项目 ……………………………………………………12 实验一、动物细胞工程常用培养液配制与检测……………………12 实验二、小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测 与结构观察…………………………………………………17 实验三、小鼠输卵管卵母细胞采集与结构观察……………………20 实验四、小鼠超数排卵及附植前不同发育阶段胚胎采集与结构观察 ……………………………………………………………25 实验五、小鼠组织细胞原代培养……………………………………29 实验六、小鼠组织细胞传代培养……………………………………32 实验七 小鼠胎儿成纤维细胞活性检测……………………………34 实验八、体外培养细胞生长曲线测定………………………………36 实验九、小鼠卵母细胞体外受精……………………………………39
实验十 小鼠胚胎体外培养…………………………………………41 实验十一 植物培养基的配制………………………………………43 实验十二 植物材料的初代培养……………………………………48 实验十三 花粉发育时期的鉴定……………………………………51 实验十四 植物离体培养物的形态观察……………………………54 实验十五 植物茎尖生长点、胚胎及花器官的剥离与观察………56 实验十六 植物离体根与植物细胞的液体培养……………………60 实验十七 植物离体培养物的继代培养与生根培养………………64 实验十八 植物原生质体的分离、纯化与培养………………………67 实验十九 植物花药的离体培养……………………………………70 第四部分 分 部分实验项目流程简 图 …………………………………72 常用培养液配制与检测………………………………………………72 小鼠精子采集与结构观察……………………………………………73 小鼠超数排卵、卵母细胞及附植前胚胎结构观察……………………74 小鼠体外受精与胚胎体外培养………………………………………75 小鼠胎儿成纤维细胞原代培养、传代培养……………………………76 细胞活性检测、生长曲线测定………………………………………76 第五部分 附录：实验小鼠的特性及饲养管理 …………………77 一、小鼠的生物学特性………………………………………………77 二、小鼠的习性…………………………………………………………78 三、小鼠生殖系统解剖…………………………………………………78 四、小鼠的生殖生理学特点……………………………………………80 五、小鼠的饲养管理……………………………………………………83
第一部分 实验室规章制度 学生实验守则 一、实验前必须预习实验教材，明确实验原理、目的、要求、方法及步骤，熟悉所用仪器设备的性能及操作规程，作好实验准备。
二、进入实验室，要严格遵守实验室各项规章制度，衣着及所携带物品符合实验要求，按规定位置就位。
三、保持室内安静、整洁，不随地吐痰，不乱扔纸屑、乱倒废物及实验产生的废料，不高声喧哗，严肃自律，不影响他人实验。
四、实验时要遵从老师指导，遵守操作规程，认真操作，仔细观察，积极思考，努力培养自己分析问题和解决问题的能力。
五、如实记录实验数据，分析实验现象，不抄袭他人实验记录，做完实验认真复查，如有错漏，及时更正或补做。
六、要爱护仪器设备，节约水、电、试剂、药品和器材。凡损坏或丢失仪器、材料、工具等，均应及时报告并登记，按规定处理。
七、实验结束要整理实验台面，收拾实验仪器、器材，打扫卫生。离开实验室时，要注意切断电源、水源、气源，经许可方可离开。
八、按时完成实验报告，认真做好实验后的复习和总结，真正掌握所学知识。
实验室安全管理制度 一、实验室对所有实验人员及学生进行安全教育，牢固树立安全意识。根据本室设备、环境及实验特点，制定防火、防爆、防盗、防事故等方面安全管理措施，严格执行。
二、仪器室、重点要害部位及使用、存放易燃、易爆物及危险品的场所要重点防护，安全措施到位，必要时设置安全监控预警系统。
三、从事生物安全相关的实验要严格按照国家的有关规定进行，在实验
中严格控制，防止病原微生物及其污染物的扩散，严格制定人员及环境保护措施，并定期检查，出现问题及时上报上级主管部门。
四、室内水电、管线设施必须按要求装配，不准乱接乱拉，随意拆装、改线。各类在用设备应保持完好安全状态，有沟、坑、井、台、洞的地方，应设盖板、护栏、警示牌。
五、实验室必须配备符合规定的消防器材，放置于明显位置，专人负责管理，定期检查，确保有效可用。
六、实验室钥匙有专人管理，不得私自配备或转借他人。工作人员离开实验室前，必须关好门、窗、水、电、气等，保管好贵重物品。节假日前，要对实验室进行全面安全检查，假期有值班，假后复查，确保安全。
七、各实验室要定期进行安全检查，发现不安全隐患，及时排除；不能自行排除的，报告有关部门处理。如发生事故，应及时采取措施，如实报告案情。凡隐瞒不报，造成重大损失的，将追究其责任。
第二部分 细胞工程基本实验室技术 细胞工程操作是基于无菌条件下进行的，需要建立一套满足无菌操作技术和无菌培养的环境。可以通过无菌操作过程获得动物组织、器官和细胞等无菌培养物，并在适宜环境条件下生长、发育、繁殖。动物配子及胚胎的体外操作也需要在相当严格的无菌条件下进行，才能获得诸如胚胎移植、胚胎体外生产、克隆动物等胚胎工程研究和应用的成功。
细胞工程的操作对象，对操作器具带来的毒性非常敏感，体外培养中任何与培养物相接触的有害物质都会影响培养物的体外生长和增殖，诸如微生物、细胞碎片以及非营养性化学物质等都可能干扰正常的实验结果。培养工作开始之前，对实验室所使用的培养器具进行彻底清洗、灭菌，清除可能残存的细胞毒性物质；即使不进行培养时，培养物操作器械、物品，也应按照这些要求清洗，消毒、灭菌。动物细胞工程实验室基本操作技术主要包括清洗、消毒灭菌、无菌操作及实验室维持等基本环节。该项操作技术虽然简单，但要求仔细耐心。它对保证实验的成功十分重要。所以，应力求通过各项操作步骤，使实验物品保持无菌状态，满足实验最基本要求。
一、清洗与包装(一)物品清洗 新的或用后的各种器皿，包括玻璃器皿、塑料器皿、金属器械、除菌滤器等都应严格清洗。
新购置的玻璃器皿，常有游离碱性物质，并附有一些对细胞和胚胎培养有害的物质，如有害金属及灰尘等，因此，新的玻璃器皿在使用前应彻底清洗并经过一定的化学处理。可先在清水中冲洗，晾干水分后在洗液中浸泡过夜，再经流水冲洗6 小时以上。必要时，还需经 1%盐酸溶液浸泡数小时，再用流水冲洗数小时，经蒸馏水漂洗 3 次以上，最后用重蒸馏水或去离子水漂洗2 次，60℃烘干备用。已用过的玻璃器皿用洗涤剂刷洗，刷洗时用力要轻，防止损伤器皿表面或造成划痕，或用超声波清洗仪清洗，清洗后用流水冲洗数小时，经蒸馏水漂洗 3 次以上，最后用多重蒸馏水或去离子水漂洗 2 次，烘干备用。
新的已灭菌的塑料器皿打开即可以使用。已用过的塑料器皿应先用清水充
分浸泡，或超声波清洗仪清洗，冲洗干净，再用 2% NaOH 溶液浸泡过夜，流水冲洗数小时，然后用 1%稀盐酸浸泡数小时，流水冲洗数小时，最后用蒸馏水漂洗 3 次，多重蒸馏水或去离子水漂洗 2 次，晾干后备用。
新的金属器皿用热洗涤剂溶液洗净，再用清水冲洗，擦干即可。
培养器皿已受微生物污染时，先用高压蒸汽灭菌后清洗。需重复使用的除菌滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，硫酸抽滤清洗，再用清水冲洗，之后用蒸馏水连续抽滤冲洗，最后用多重蒸馏水连续抽滤冲洗，烘干备用。
应以耐酸、耐热、开口较大的容器盛装洗液。可根据需要选用不同强度的洗液（表 2－1），配制洗液的方法是：①按照上述配方，将需要量的重铬酸钾和蒸馏水加到选用的容器内；②向容器内缓慢、分次加入浓硫酸(工业硫酸即可)，轻轻搅拌溶液，以加快散热及促进重铬酸钾溶解。加入浓硫酸时切勿过急，以免液体骤热，发生危险；③自然冷却。
表 2-1 洗液配方 成 分 强酸溶液 次强酸溶液 弱酸溶液 常用配方 重铬酸钾(g)60 100 50 100 浓硫酸(mL)800 200 100 200 蒸馏水(mL)200 1000 1000 800 新配制的洗液呈棕红色。配制和使用洗液时，操作者须戴耐酸手套。浸酸的器具一定要晾干，以免将水分带入洗液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后取出器皿时，须小心操作，防止液体溅出，伤及操作者皮肤或衣服。将器皿从洗液中取出时，应滴干洗液。当洗液的颜色变暗、发绿或浑浊时，说明已使用过久，效力降低，应重新配制。
(二)清洗后物品的包装 洗净烘(晾)干的物品应及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品也便于消毒灭菌和贮存，同时可防止消毒灭菌后再受污染。包装常用硫酸纸、牛皮纸、纱布、棉布、锡箔纸、铝盒、饭盒、专用金属消毒筒等。包装的方式根据消毒灭菌的方法而有所不同。
对于体积较大的器皿(如大烧杯、烧瓶等)及滤器等容器，可采用局部包装的方法。把开口部分用硫酸纸及牛皮纸或棉布等两层紧密包装，包好后用棉线绳扎紧。对于较小的器皿，如培养皿、玻璃吸管、注射器、胶塞等可以用硫酸纸及牛
皮纸等两层整体包装；金属器械、棉塞等可以先装入铝盒、饭盒或消毒筒中，然后用棉布全部包裹起来；手术器械、手套、工作衣等可以用布直接包裹。一般全包装物品体积不能过大，可以用线绳捆扎，但不可太紧。放有物品的铝盒、饭盒或消毒筒等的底部和四周需要有多处通气孔，盒盖或筒盖不宜过紧。多个相同容器不易辨别时，应分别注明内装用品的名称，每一容器内的用品不宜放置过多、过密。注射器的针筒和针芯要分开并一起包装。吸管包装盒的底部垫一些脱脂棉或软纸、纱布，管口放入少许脱脂棉或纱布，包装松紧适宜，以免吸管头被撞断。
二、消毒灭菌 严格的消毒灭菌对细胞与胚胎工程研究与应用工作极为重要，直接影响着整个实验能否顺利进行。
(一)消毒灭菌方法 目前常用的消毒灭菌方法多采用物理方法(如干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤除菌法、射线杀菌法等)和化学方法（消毒剂、抗生素）两大类。
1 1 ．干热灭菌法 是利用恒温干燥箱内120ºC～150ºC 的高热，并保持 90～120 min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的一种方法。主要适用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌，且不易被高温损坏的玻璃器皿、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品的灭菌。用此方法灭菌的物品干燥，易于贮存。酒精灯火焰烧灼灭菌法也是属于干热灭菌的方法之一，在进行动物细胞体外培养工作时，常须利用工作台面上的酒精灯火焰对金属器具及玻璃器皿口缘进行补充灭菌。
2 2 ．湿热灭菌法 压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1 kg/cm 2，维持20～30 min 即可达到灭菌效果。饱和蒸汽压力与其对应的温度见表 2－2。
3 3 ．射线灭菌法 利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作
用而使其灭活。适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为 30 min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。
表 2-2 饱和蒸汽压力与其对应的温度 饱和蒸汽压力 温度(ºC)饱和蒸汽压力 温度(ºC)kg/cm 1 b/in 2 kg/cm 1 b/in 2 0.0 0 100 1.055 15 121.0 0.141 2 103.6 1.125 16 122.0 0.281 4 106.9 1.266 18 124.1 0.442 6 109.8 1.406 20 126.0 0.563 8 112.6 1.543 22 127.8 0.703 10 115.2 1.681 24 129.6 0.844 12 117.6 30 134.5 0.984 14 119.9 50 147.6(引自周维燕，1999)4 4 ．过滤除菌法 是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45 μm 范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。
5 5 ．化学消毒剂消毒法 用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用 70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌；利用甲醛加高锰酸钾[(2 mL 甲醛+1 g 高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6 mL/m 3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。在使用时应注意安全，特别是用在皮肤或实验材料上的消毒剂，须选用合适的药剂种类、浓度和处理时间，才能达到安全和灭菌的目的。
6 6 ．抗生素抑菌法
主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。
(二)不同种类物品及培养物的消毒灭菌方法 1 1 ．无菌操作室灭菌 培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌，熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2 mL 甲醛+1 g 高锰酸钾)/m 3 ]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射 30 min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射 30 min，然后用70%～75%酒精擦拭。
2 2 ．培养液灭菌 培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在 24 小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。
使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量（淹没加热管）凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至 0.35~0.4 kg/cm 2 时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1 kg/cm 2 为 121ºC，保持15~20 min 即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。在 121ºC 的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0~1.1 kg/cm 2、121ºC。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表 2-3)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。
培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在 40ºC
左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。液体培养液在冷却到室温后再加入过滤除菌溶液。过滤除菌时，使用孔径为 0.22～0.45 μm 或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应进行高压消毒灭菌，温度不应超过 121ºC。
表 2-3 培养液高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 容器容积(mL)在 121ºC 下所需的 最少消毒灭菌时间(min)容器容积(mL)在 121ºC 下所需的 最少消毒灭菌时间(min)20～50 15 1000 30 75 20 1500 35 250～500 25 2000 40(引自李浚明, 1992)3 3 ．玻璃器皿、塑料 器皿和器械灭菌 玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌后最好及时烘干水分。对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿可用 75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫外线重复杀菌。实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进行消毒，消毒后的器皿要充分散气 2～4 h 后才可使用。无菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用 75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线重复杀菌；在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。常用消毒剂消毒灭菌效果比较见表2-4。
表 2-4 常用消毒剂消毒灭菌效果比较表 消毒剂 使用浓度(%)去除的难易 消毒时间(min)效果 次氯酸钙 9～10 易 5～30 很好 次氯酸钠 2 易 5～30 很好 漂白粉 饱和溶液 易 5～30 很好 溴水 1～2 易 2～10 很好 过氧化氢 10～12 最易 5～15 好 升汞 0.1～1 较难 2～10 最好 酒精 70～75 易 0.2～2 好 抗菌素 4～5(mg/L)中 30～60 较好 硝酸银 1 较难 5～30 好(引自曹孜义，1999)4 4 ．培养材料的消毒灭菌 采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消
毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢（10%~12%，浸泡 5~15 min）、过氧乙酸（0.05%，浸泡 30 s~1 min）、酒精（70%~75%，浸泡 2 min）。动物细胞工程实验中常用物品的消毒灭菌方法选择见表 2-5。
表 2-5 动物细胞与胚胎工程实验中常用物品的消毒灭菌方法选择 消毒灭菌物品 压力蒸汽 干热 过滤 紫外线 化学气体 化学消毒剂 培养室、工作台 + + + 玻璃制品 + + 金属器械 + + + 塑料制品 + + 橡胶制品 + + + 培养液 + + 棉、布类 + + 培养物 + 三、无菌操作(一)无菌操作前的准备工作 培养材料接种时的无菌操作过程除上述各项消毒灭菌操作外，还需完成以下无菌操作步骤，从而获得接种的无菌培养材料。
工作人员无菌操作前需用肥皂刷洗双手及手臂，并用流水冲净，并对手臂消毒后穿戴好灭菌工作服、工作帽和口罩，更换拖鞋，才能进入无菌操作区。如进入层流操作室进行实验操作，应完成缓冲准备区内的淋浴、一次更换灭菌衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更换灭菌防护衣帽、手套、拖鞋等；再在风淋区进行无菌风淋后方可进入层流操作室。进入无菌操作区后，再用 70%～75%的酒精擦拭双手和前臂，完成无菌操作准备工作。
用 70%～75%酒精擦洗工作台面后，将已消毒灭菌的实验用品取出，并将操作器械放置在无菌器械支架上，然后开始实验操作。在实验操作过程中，对所有操作器械每次使用后都要进行灭菌，常采用酒精灯火焰灼烧灭菌。
(二)无菌操作步骤 准备工作完成后，对来自于自然生长条件下的外植体，按上述培养材料消
毒方法灭菌后取出，放入已灭菌的培养皿中，然后置超净工作台酒精灯火焰下方，用灭菌剪刀等器械进行适当分离、切割或其它处理后备用。在酒精灯火焰处将培养容器的瓶塞(盖)轻轻打开，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子将培养材料置入培养液上，将镊子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精灯上灼烧后放回支架，然后迅速灼燎瓶塞(盖)数秒后塞回瓶口。对继代培养材料的无菌操作，需在灯焰处打开瓶塞(盖)，继代材料为液体培养细胞时直接用灭菌吸管吸取培养细胞液放入新培养液中；继代材料为固体培养细胞时用灭菌镊子挑取适量材料置新培养液上；继代材料为其他组织时，用灭菌剪刀或其他器械进行培养材料适当切割后，用灭菌镊子将其置于新培养液上(中)，然后迅速灼燎瓶塞(盖)数秒后塞回瓶口。
(三)污染源及其表现特征 当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等消毒灭菌不彻底时，培养材料则携带有微生物(microorganism)，当其被转接到营养丰富的培养液上时，微生物繁殖迅速，出现各种污染菌斑。微生物生长时分泌出对动物组织有毒的代谢废物，致使培养材料死亡或失去使用价值。在培养过程中，培养材料附近出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫，这是细菌性污染。在细菌性污染中，特别要注意一种呈乳白色的芽孢杆菌污染，它可出现在培养液表面，或呈滴形云雾状存在于培养液内，若出现应严格灭菌。而培养液表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染。
四、实验室维持 实验室的日常维持是动物细胞工程实验室所必须进行的。在实验室工作的每一位研究人员都应该被安排在一定范围内承担实验室维持工作任务，以便使实验室保持在一个好的工作状态和工作秩序。首先，进入实验室时，应该保持实验室的整洁、干净和整齐，一旦混乱就容易造成污染隐患。一个实验室的维持工作最好是有常用实验室的实验人员共同承担，给每个人指定如离心机、抽屉、培养箱等实验区域的维持任务。如果有很多人在实验室工作，更有效的方法是列出值日表，明确每个人的任务。
(一)实验室日维持任务 进入实验室工作的所有人员，在每天进行实验工作的前、后，用适当的消
毒剂，如 70%乙醇进行擦拭。废物容器和废液体应带出细胞培养室，并在每天工作完成后将其清除。如果有任何污染培养物需要废弃，应立刻从培养室移出，并进行高压蒸汽灭菌处理。按照生物安全条例，细胞培养废物应作为生物危害处理，含有细胞的干废物应放置在生物安全袋并进行高压蒸汽灭菌处理，液体废物应使用或消毒剂进行消毒处理。如果任何液体洒在了仪器、垃圾或地板上，应立即进行清洁并立即消毒。每次使用前后应进行紫外线杀菌处理，但不要通宵开启送风设备和杀菌灯。每天工作结束后，关闭显微镜、细胞计数仪及其他应该关闭的仪器设备。检查培养箱的温度和 CO 2 指示。最后离开的人员应重新检查一遍上述工作是否完成。
(二)实验室周维持任务 每周应该检查一次所有液氮储存罐的液氮面高度。检查培养箱湿度盘的水量。补充无菌贮藏柜的物品。无血清培养时，应及时订购生长因子、激素及其他所需的化学试剂，最好在冰箱或冷藏柜外面贴上这些化学物的列表。
(三)实验室月维持任务 实验室月维持任务很少经常进行，但至少应该定期进行一次。每月应进行一次室内清洁，包括地板及天花等，要求用新的抹布和新鲜溶液进行地板清洁。拆解培养箱，对各个培养室部件进行消毒；进行培养箱温度和 CO 2 水平的校正，如果具有自动调零功能，至少应 1 年 1 次，最好半年 1 次。进行工作台面的清洗和彻底消毒。检查所有移液管的精确度。检查细胞计数仪，检查清洁纯水器或更换过滤单位。清洁离心机、冷冻仪。检查弃除过期液体。仔细检查冰箱贮存液体有无霉菌生长。清洁、检查和整理显微镜。
第三部分 实验项目 实验一 动物细胞工程 常用培养液配制与检测 一、实验目的 本实验要求学生掌握动物细胞工程液体配制的准备工作，学习干热灭菌和高压蒸汽灭菌的程序和方法；掌握常用操作液及基础培养液的基本配制和质量检测方法；为动物组织、细胞、配子和胚胎的操作做好基础准备。
二、实验原理 动物细胞工程的主要操作对象是离体条件下动物有机体的各部分组织、器官或细胞，这些用来进行离体培养的组织或器官称为外植体；动物胚胎工程的主要操作对象是配子和胚胎。要满足操作对象在离体条件下正常生存和生长发育，就必须为其提供适宜生长发育的良好营养条件，即培养液条件。动物的细胞、组织、配子或胚胎在营养代谢、生长发育等多方面相比较，存在着诸多差异，营养需求也不尽相同。所以在进行动物组织、细胞及配子、胚胎的离体操作或培养时，需要配制不同的操作液或培养液。因此，了解培养液的组成与掌握其配制方法是动物细胞工程研究与实验的一项基本任务。
由于动物细胞工程操作对象的特点，常用操作液及培养液一般配制为液体状态。操作液及培养液中一些成分在溶液中不稳定，配制时一般先将液体的最基本成分配成基础液，使用前将这些成分作为添加成分加入基础液最终配制成操作液及培养液，不同的培养液及不同的实验室在添加这些成分时采用的方式有所不同。
动物细胞工程的操作是基于无菌条件下进行的，需要建立一套满足无菌操作技术和无菌培养的环境，配制无菌的液体为最基本的条件。而液体在制备过程中往往带有各种杂菌，配制成液体后应立即灭菌，或在24 h 内完成灭菌工序。由于动物细胞工程操作液和培养液组成成分中常含有遇热易分解的物质，所以多采用过滤方法除去操作液和培养液中的细菌，并在过滤除菌时完成分装。
为了检验配制的液体是否仍有细菌污染，配制成的液体应间隔一定时间进行检查，如颜色是否变化、是否发生浑浊以及是否有菌落出现等，如有必要可
进行培养检查。
三、实验材料和用具 教材或讲义中实验室配置部分已涉及到的不需要专门准备的固定仪器设备和物品不再列出，在此列出需要在本实验前检查、调试、准备的仪器设备、器械物品、药品、试剂。
实验者用品：工作服，帽子，口罩，拖鞋，肥皂，手消毒桶及消毒液，75%乙醇，酒精喷壶。
清洗用品：洗涤剂，水桶，水盆，瓶刷，试管刷，超声波清洗仪，蒸馏水（一蒸水和二蒸水），塑料篮或不锈钢篮，控水架，干燥箱。
消毒、灭菌用品：电炉，高压蒸汽灭菌器，鼓风干燥箱，纱布，棉布，牛皮纸，硫酸纸，棉绳，铝盒，饭盒，酒精灯，火柴，酒精棉球。
液体配制用品：超净工作台，精密电子天平，药匙，称量纸，烧杯（1000 mL、500 mL、100 mL），放水瓶，四蒸水或超纯水，玻璃棒，吸水纸，滴瓶，滴管，量筒，注射器，移液器，移液器吸头，吸头盒，移液器架，漏斗，容量瓶（1000 mL、500 mL、100 mL），蒸馏水（三蒸水或四蒸水）或超纯水，磁力搅拌器，酸度计及精密 pH 试纸，针头滤器及滤膜，玻璃瓶，瓶塞，封口膜，标签纸，剪刀，胶布，记号笔。
药品、试剂：1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl，本实验指导各液体配方成分。
四、实验方法(一)液体配制的准备 1 1 ．仪器设备的检查调试 液体配制涉及的仪器设备，如高压蒸汽灭菌器、鼓风干燥箱、精密电子天平、超净工作台等，在使用前按照说明书，在工作状态下进行检查、调试。
2 2 ．物品洗涤及消毒灭菌 按照第二部分介绍的清洗程序，将与液体及其成分接触的物品清洗干净、蒸馏水漂洗后，60℃烘干。用于药品试剂溶解、混合、定容的器皿即可使用。用于液体无菌处理和分装的器皿及物品进行包装，耐高温的器皿及物品采用恒温鼓风干燥箱进行干热灭菌；不耐高温的物品采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭
菌，湿热灭菌的物品应再烘干。
(二)常用操作液及培养液的配制 以实验项目中常用的操作液和培养液为例，介绍液体配制方法。
1 1 ．无 Ca2+、无 Mg2 2+ + 磷酸盐缓冲液 [PBS(--)] 无 Ca2+、无Mg 2 2+ + 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)常用作细胞培养的操作液。配制方法为，称量 NaCl 10.0 g，KCl 0.25 g，Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 1.44 g，KH 2 PO 4 0.25 g，四蒸水 500 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，1000 mL 容量瓶定容，分装，15 磅高压蒸汽灭菌30 min，4℃冰箱保存。
2 2 ． 0.25 5 ％胰蛋白酶细胞消化液 胰蛋白酶0.25 g，EDTA 0.04 g，PBS(-)液 100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22 μm 滤膜正压过滤，4 mL/瓶分装，-20℃冰箱保存。
3 3 ．M DMEM 细胞培养液 DMEM 液(dulbicco’s minimal essential medium)主要用于细胞培养。称量高糖DMEM 粉 13.4 g，NaHCO 3 3.7 g，分别加四蒸水 300 mL，磁力搅拌充分溶解，再将 NaHCO 3 溶液缓慢加入 DMEM 液中，1000 mL 容量瓶定容，调pH 7.2，加血清 110 mL，80 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素，0.22 μm 滤膜正压过滤，分装，4℃冰箱保存。
4 4 ．改良杜氏磷酸盐缓冲液（m m PBS）改良杜氏磷酸盐缓冲液（modified phoaphate buffer solution, mPBS）(表 3－1)常用作胚胎回收的操作液（冲卵液）。
配制过程：
表 3-1 改良杜氏磷酸盐缓冲液成分 成分 分子量 含量(mmol)称量(mg/L)A 液 NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 葡萄糖 丙酮酸钠 青霉素 链霉素 牛血清白蛋白 58.44 74.65 141.96 136.09 180.16 110.05 136.89 2.68 8.09 1.47 5.56 0.33 8000 200 1150 200 1000 36 70 50 3000 B 液 CaCl 2 110.99 0.90 100 C 液 MgCl 2.6H 2 O 203.31 0.49 100
①分别制备A、B、C 三种溶液，三蒸水量加至最终量的 80%，置冰箱冷藏室中冷却后依次混合，可防止沉淀，然后用容量瓶定容至 1000 mL。为了指示pH 值，可加入酚红，但它不是PBS 的成分，一般加 1.0%(g/mL)溶液 1.0 mL/L。
②用 0.2 mol/L NaOH 或0.2 mol/L HCl 调整 pH 至 7.1～7.2(如蒸馏水新鲜，称量准确无误，配成后pH 即为 7.1～7.2，不必调整。实际应用时，若pH 不准，也可能是蒸馏水、试剂或称量准确性问题)。使渗透压稳定在约 290 毫摩尔渗透压浓度(mOsm)。
③如试剂含结晶水量与配方不符，应按分子量换算。对易吸潮的试剂，要在配制前烘烤干燥。烘干温度要查阅化学手册，以不使试剂分解或损失分子中的结晶水为原则。
④用 G6 滤器抽滤除菌，或用针头滤器安装滤膜后正压过滤除菌。
⑤在制备过程中，特别是过滤、分装时要严格遵守无菌操作规程。配制好的液体分装密封后，标明配制日期。4℃冰箱中可保存 1～4 个月。不可在冰箱冷冻室或低温冰箱中保存，否则会有盐类结晶析出。
⑥临用前按需要量加入牛血清白蛋白或灭活的胎犊血清、新生犊牛血清。一般在冲卵液中加入血清的浓度为 2％～5%。为了使用方便，可在过滤前加入血清，然后再过滤分装。血清灭活可除去血清中的毒胚因子，灭活方法是把血清在 56℃下维持 30 min。
5 5 ．B CZB 液 CZB液为Chatot CL,Ziomek CA和Bavister BD于1989年发表的专为克服小鼠胚胎体外培养中 2-细胞阻滞的培养液，并以三人的名字缩写简称为CZB 液。其基本组成成分见表 3-2。其特点是在早期卵裂阶段不使用可能导致胚胎发育延迟和发育阻滞的葡萄糖，而使用谷氨酰胺克服小鼠胚胎的 2-细胞阻滞。但早期胚胎发育到后期，需要在含 5.56 mmol/L 浓度葡萄糖的 CZB 液中培养 48 h，可很好地支持桑葚胚发育到囊胚。近年来，CZB 液及其改良液体常被用于小鼠胚胎体外操作和培养的液体。
6 6 ．M KSOM 液 KSOM 液最早为 Lawitts 和 Biggers(1991,1992)发表的 SOM 液(simplex optimized medium)，可支持受精卵克服 2-细胞阻滞。后来，SOM 液的 NaCl 和KCl 浓度被提高后(Lawitts 和 Biggers 1991，Erbach et al 1994)，新的液体被称为KSOM。KSOM 液培养小鼠胚胎时，有较高的细胞体外培养分裂率，囊胚发育
率较高。KSOM 液的基本组成成分见表 3-3。
表 3-2 CZB 液成分 成分 分子量 含量(mmol)称量(mg/L)NaCl 58.44 81.62 4769.88 KCl 74.65 4.83 360.56 KH 2 PO 4 136.09 1.18 160.58 CaCl 2 /CaCl 2.2H 2 O 110.99/147.02 1.71 186.9/251.4 MgSO 4 /MgSO 4.7H 2 O 120.37/246.47 1.18 142.04/290.83 NaHCO 3 84.01 25.12 2110.33 乳酸钠 112.07 31.3 3507.79 丙酮酸钠 110.05 0.27 29.71 谷氨酰胺 146.15 1.0(4-细胞前)146.15 葡萄糖 180.16 5.56(4-细胞后)1001.69 EDTA(二钠盐)336.21 0.11 36.98 牛血清白蛋白 4000 青霉素 70 链霉素 50 酚红 10 表 3-3 KSOM 液成分 成分 分子量 含量(mmol)称量(mg/L)NaCl 58.44 95.7 5592.7 KCl 74.65 2.48 185.13 KH 2 PO 4 136.09 0.35 47.63 MgSO 4 /MgSO 4.7H 2 O 120.37/246.47 0.20 24.07/49.3 NaHCO 3 84.01 25.0 2100.25 CaCl 2 /CaCl 2.2H 2 O 110.99/147.02 1.71 186.9/251.4 乳酸钠 112.07 10.0 1120.7/60%,1870 丙酮酸钠 110.05 0.20 22.01 葡萄糖 180.16 0.20 36.03 EDTA(二钠盐)336.21 0.01 3.36 牛血清白蛋白 2000 青霉素 60 链霉素 50 酚红 10(1 mL,1%)
CZB 液及 KSOM 液的配制方法：用四蒸水或超纯水溶解 NaCl、KCl、KH 2 PO 4、NaHCO 3、乳酸钠等基本成分及丙酮酸钠、EDTA、青霉素、链霉素等添加成分，共同组成 A 液；CaCl 2 和 MgSO 4.7H 2 O 分别溶解，为 B、C 液。将三种液体在 4℃冰箱降温后混合，以防止沉淀，混合后用蒸馏水定容。之后加入酚红(1%，L/mL，加入量 1000 L/L)，观察颜色并用精密试纸和仪器测定 pH 值，并用 0.2 mol/L HCl 或 0.2 mol/L NaOH 调 pH 到7.3±0.1。用滤器进行细菌过滤，分装备用。谷氨酰胺、葡萄糖则先配成高浓度的母液，临用时将母液加入培养液而达到最终浓度；血清或 BSA 则分成小包装，在临用时加入培养液，血清终浓度一般为10%～20%(V/V)，BSA 终浓度一般为 4000 mg/L。使用时按所需浓度加入血清、BSA 和谷氨酰胺后，用 0.22 μm 的滤膜再次进行细菌过滤。另外需要注意的是，将 BSA 加入培养液时勿搅拌或剧烈晃动，以免产生大量泡沫，应将所需量BSA 撒在液体表面，待其自溶或轻轻晃动溶解。
五、实验报告及思考题 1．详细描述自己在实验中配制液体的程序和方法，并思考下面的问题。
2．动物细胞工程所用操作液及培养液为何常用过滤除菌法除去细菌。
3．液体配制时为何要将组分分类溶解，然后混合？ 4．培养液中的一些组分为何在使用前才能加入培养液？ 实验二 小鼠睾丸、附睾及输精管精子 采集、运动能力检测与结构观察 一、实验目的 本实验要求学生掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法；掌握血球计数板法精子计数和运动能力检测的方法；通过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测，认识精子在睾丸产生后，在附睾内成熟的过程；掌握精子抹片方法；掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察的方法，认识精子的正常结构。
二、实验原理
哺乳动物的精子形成后必须经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的变化而最终达到成熟后，才能获得向前运动的能力，这种向前运动是精子受精能力的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部二个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成头部和尾部的连接。精子头部主要包括由核组成，头部前端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末段。
三、实验材料和用具 实验人员用品，清洗用品和消毒、灭菌用品见实验一。
精子采集与计数用品：隔水式恒温培养箱，CZB 液，KSOM 液，注射器，器械盘，镊子，手术剪，眼科剪，眼科镊，眼科异物针，表玻皿，5 mL 试管，体视显微镜，生物显微镜，擦镜纸，恒温水浴锅，血球计数板。
精子结构观察用品：吸水纸，滴瓶，滴管，载玻片，盖玻片，剪刀，胶布，记号笔。
操作液体：0.5%龙胆紫酒精；精子固定液(福尔马林磷酸盐缓冲液)；姬姆萨液(原液，使用时以 1：9 的比例用磷酸盐缓冲液配成工作液)。
实验动物：选择 60 日龄以上，体重达到 35g 的体成熟昆白系公鼠。
四、实验方法(一)精子采集 左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图 3-1 所示方法，以颈部脱臼法处死实验鼠。仰卧，用用 75%酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统(图 3-2A，B，图5-1，)。无菌采取分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液的表玻皿中，用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。
图 3-1 颈部脱臼法迅速处死小 鼠的方法(引自 A.纳吉等，2003)
将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、其余部分的输精管三部分，弃去附睾头。采集睾丸精子时，将睾丸横切为若干段或组织块，放在表面皿中，加1 mL 培养液，用眼科镊子轻轻挤压睾丸组织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块。于 37℃、5% CO 2、饱和湿度条件下孵育 20 min，使精子自行散开。采集附睾尾精子时，将其剪成几段，用眼科镊子轻轻挤压附睾和输精管，把精子挤入培养液中，去掉附睾和输精管。于37℃、5% CO 2、饱和湿度条件下孵育 20 min，使精子自行散开。采集输精管精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗管腔，将输精管放入含有 1 mL 培养液的表面皿内，在立体显微镜下，用一支眼科用异物针固定输精管，用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精子会浮游到稀释液中。将大块输精管组织拨开，用吸管连同精子吸出液体部分，装于 2 mL 具塞试管中暂存。
(二)精子运动能力检查 用滴管吸取精液，放于血球计数板的计数室与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。计数中间 5 个中方格(对角 5 个或四角及中间)内 80 个小方格的精子数，计数值为 X。计算时，先计数死精子的 X 1 值，将计数板置于 50℃水浴锅中的搪瓷盘中，在50℃条件下10 min杀死精子，计数总精子数X 2 值，(X 2-X 1)/X 2为精子运动能力。计数时每份精子用三个计数板重复计数三次，取平均值。
(三)精子整体结构观察 取 1 小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉的形式制成抹片。用 0.5%龙胆紫酒精染色 3 min，自然干燥、水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形(如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、皱缩、缺损、双头等)，颈部畸形(颈部膨大、纤细、屈折、不全、双颈等)，尾部中段畸形(膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等)，尾部主段畸形(弯曲、屈折、回旋、短小、长大、双尾等)分类计数。有的精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可视为畸形精子。
(四)精子顶体结构观察 精液抹片自然干燥 2～20 min，以 1～2 mL 的福尔马林磷酸盐缓冲液固定15 min，水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色 90 min，水洗，风干。置于 1000
倍显微镜下用油镜观察、计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常，部分精子顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。
五、实验报告及思考题 1．详细描述自己在实验中进行小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测及结构观察的程序和方法。
2．雄性小鼠的生殖器官主要由哪几部分组成？ 3．我们为何要进行睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测，从中能验证什么基础理论问题？ 4．绘制小鼠精子结构图。
5．从外观上看小鼠精子由哪几部分组成，你都观察到了哪几种畸形结构，将典型的畸形结构进行图示。
6．试述精子顶体的重要性，你都观察到了哪几种顶体异常情况。
实验三 小鼠输卵管卵母细胞采集与结构观察 一、实验目的 初步认识小鼠的雌性生殖器官结构组成及其位置，认识卵巢、输卵管、子宫等生殖器官；学会输卵管壶腹部采集卵母细胞的方法，能在卵母细胞采集液体中检出卵母细胞，初步认识小鼠的卵母细胞内部及外部结构。
二、实验原理 哺乳动物的卵子发生在卵巢的卵泡内进行。在卵母细胞成熟发育阶段，初级卵母细胞发生生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)现象，并完成第一次成熟分裂(减数分裂，以同源染色体分离为特征)，并排出第一极体。一般认为，GVBD 的发生和第一极体的排出是卵母细胞核成熟的标志。之后，次级卵母细胞进行第二次成熟分裂(一般为有丝分裂，以染色单体分离为特征)，并停滞在第二次成熟分裂中期。在这期间，完成胞质的最后成熟。这时，卵泡发育成熟，将处于第二次成熟分裂中期的卵母细胞连同周围的卵丘细胞随着卵泡液排出。排出的卵母细胞经过输卵管漏斗部进入输卵管，运行到受精部位输卵管膨大部（壶腹部）。卵母细胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接着形成一个已受精的合子并放出一个小的第二极体。
三、实验材料和用具 实验人员用品，清洗用品和消毒、灭菌用品见实验一。
激素分装与稀释用品：微量电子天平，药勺，青霉素瓶，胶布，记号笔，生理盐水。
超数排卵用品：注射器（1 mL），针头(5 号半)，孕马血清促性腺素（PMSG），人绒毛膜促性腺素（hCG），酒精棉球，镊子。
卵母细胞采集及观察用品：体视显微镜，擦镜纸，恒温水浴锅，隔水式恒温培养箱，器械盘，手术剪，手术镊子，眼科剪，眼科镊子，眼科异物针，表面皿，卵母细胞吸管及胶头，检卵杯，酒精棉球，吸管，注射器（2 mL，5 mL），针头，针头盒，胚胎回收操作液(mPBS)，酒精灯。
实验动物及准备：昆白系小鼠。为了获得较多的卵母细胞，需要对母鼠进行超数排卵处理。一般情况下，达到性成熟的小鼠在超排时排卵数多于成年鼠，故常使用刚达到性成熟的青年母鼠进行超排。一般选择 6 周龄左右，体重 22～25 g 青年小鼠。从实验动物饲养场购得的小鼠，需要在光控周期条件下饲养 5～7 天，调节其生理周期，使其进入发情期。一般采用光照14 h、黑暗 10 h 的光照周期。输精管结扎公鼠的准备过程为，选择60 日龄以上的公鼠。于实验前两周对公鼠进行输精管结扎。公鼠麻醉，腹部消毒，然后切开皮肤及肌肉层，打开腹腔，取出睾丸及附睾，分别对两侧输精管间隔一段距离作两处结扎，并用眼科剪从中间剪断，缝合创口。
四、实验方法 1 1 ．激素的分装、配制 激素厂家生产的超排用生殖激素，如孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素等。用于小鼠超排时，其包装剂量较大，一般不会一次用完。而由于这些激素的化学特性，一旦经过稀释，在溶液中的生物学活性会很快下降并失活，大剂量稀释后即使不用也不能保存多久。所以，在使用前应将市售包装进行分装。分装时，需要自行称量一个包装的激素净重，按照净重与该包装标示的激素单位，换算出每单位重量的激素单位数。然后根据每次超排需要使用激素的单位数，用精密电子天平对激素进行称重、分装，装入灭菌的干燥青霉素瓶中，用胶布密封每个小包装，并用记号笔标记日期、重量及激素单位数，放入 4℃冰箱待用。临用前，取出一个小包装，按照每只小鼠腹腔注射 0.2 mL(或 0.5 mL)的溶液量，用溶剂(一般用灭菌生理盐水)进行稀释。
2 2 ．小鼠超排处理日程安排与超排处理 小鼠超数排卵及卵母细胞回收日程安排见表 3-4。
表 3-4 小鼠超数排卵及卵母细胞回收日程安排 日期 处 理 0 天下午 3:00～5:00 注射 PMSG 8～10 单位 2 天下午 5:00～7:00 注射 hCG8～10 单位，母鼠与输精管结扎公鼠配对，同笼过夜 3 天上午 7:00～8:00 观察记录配种♀鼠阴栓情况 3 天上午 输卵管采集卵母细胞 于实验开始的当天（0 天）下午 3:00～5:00，选择阴门淡粉红色的雌性青年小鼠，这时小鼠正处于临近发情开始前，进行超排处理效果较好。抓住小鼠后，腹腔注射 PMSG 8～10 单位。于注射 PMSG 后的 48～50 h，再给每只超排鼠腹腔注射 hCG 8～10 单位，然后将处理的雌性小鼠 1～2 只放入一个笼子里，稍后放入 1 只结扎雄鼠同笼过夜。第3 天上午 7：00～8：00 前，观察并记录配种母鼠的阴栓情况。
3 3 ．小鼠卵母细胞采集及结构观察 颈椎脱臼法处死实验小鼠，用 70％的酒精棉球消毒腹部。在下腹部中间剪开一个小口(图 3-2A)，两...
