厌氧复合发酵实验方案

作者：全面小康42948 | 发布时间：2022-11-18 10:04:55 收藏本文下载本文

厌氧复合发酵实验方案

1.01 菌种概述

1.1鼠李糖乳杆菌

鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GG (简写为Lactobacillus GG或LGG )多存在于人和动物的肠道内，细菌分类学属于乳杆菌属，鼠李糖亚种，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌不能利用乳糖，可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。

LGG在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道，而其他大部分益生菌种在进入肠道前就已经因胃酸和胆汁的作用而死亡[1]。如：普通酸奶中保加利亚乳酸杆菌在pH3.0条件下，半小时后活菌数降为原来的5%左右，1小时后活菌数降为原来的0.5%左右。对双歧杆菌而言，30℃、pH4.0对其存活有较大影响，2小时后活菌数降低70%~90%以上，pH2.0时则衰减更快，嗜酸乳杆菌的情况与双歧杆菌相似[2]。LGG可以定殖在人体内长达两周之久，能有效改善和调整人体胃肠道菌群群落，对人体健康非常有益。能否定殖于人体对于一种益生菌的生理作用发挥将有很大的影响，而其他大部分益生菌种均不能定殖于人体[3]。

1.2 枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种，CAS号68038-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，是一种需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉[4]，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

枯草芽孢杆菌为需氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境, 促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖[5], 维持肠道生态平衡。枯草芽孢杆菌还能够分泌淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、和纤维素酶等多种内源酶，枯草杆菌生长速度快, 对营养要求比较低, 能高效分泌许多蛋白及代谢产物, 且其不会产生毒素, 是一种无致病性的安全微生物。在医药卫生食品等方面用途很广。在微生物实验中, 常用检测观察枯草杆菌的培养基配方:1 L蒸馏水 +20 g葡萄糖 +15 g 蛋白胨 +5 g 氯化钠 +0. 5 g牛肉膏 +20 g琼脂。

1.3 酪酸梭菌

酪酸梭菌（Clostridium butyricum）又称酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸杆菌，酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸梭菌，丁酸杆菌，丁酸菌是人的正常肠道菌之一，严格厌氧，为革兰阳性菌。

酪酸梭菌对肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌和霍乱弧菌均有显著的抑制作用, 尤其是对霍乱弧菌抑制作用更强, 对婴儿双歧杆菌不但无拮抗作用, 且有促生倾向。酪酸梭菌的抑菌原因, 是酪酸梭菌本身在生长过程中能产生一系列短链脂肪酸, 如酪酸、醋酸和乳酸, 这些酸性代谢产物能迅速降低培养液的pH 值, 不利于致病菌的生长代谢, 从而起到抑菌作用[6]。

2 材料及仪器

2.1 材料及药品

鼠李糖乳杆菌低温保藏菌种1支、枯草芽孢杆菌保藏菌种1支、酪酸梭菌保藏菌种1支、MRS液体培养基成品粉1瓶、LB液体培养基成品粉1瓶、RCM液体培养基成品粉1瓶、CGM液体培养基成品粉1瓶、带肥膘猪肉（脂肪：精肉≈1:9）若干、麦麸若干、硫酸铜(CuSO4·5H2O)。硫酸钾(K2SO4)、硫酸(H2SO4)、

硼酸(H3BO3)、甲基红指示剂(C15H15N3O2)、溴甲酚绿指示剂(C21H14Br4O5S)、亚甲基蓝指示剂(C16H18ClN3S·3H2O)、氢氧化钠(NaOH)、95%乙醇(C2H5OH)、甲醛溶液（CH3CHO）、石油醚（沸程60~90℃）分析滤纸若干、石英砂若干、

2.2 仪器及设备

培养皿若干、100ml血清瓶32个、恒温振荡器（温程：25~45℃或更广）50ml锥形瓶6个、250ml锥形瓶4个、50ml容量瓶3个、250ml容量瓶2个、500ml容量瓶2个、超净工作台、紫外分光光度仪、电子天平（感量为0.1mg和0.01g的各一台）、凯氏定氮仪及其配套玻璃仪器、电炉、脂肪抽提仪及其配套玻璃仪器、扁形称量瓶、干燥器、烘箱、

3 方法

3.1 种子液的制备

（注：以下为保藏菌种所适用的活化方法，若使用直投式菌粉则不用活化）

3.1.1 鼠李糖乳杆菌

为提高菌种的活力，将菌株接种到液体MRS 培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24~48 h，连续活化3代。将活化至第3代的菌液，以1％的接种量接种于液体MRS培养基中。为了确保菌种在传代过程中的稳定性，每次将菌株培养至稳定期时再进行转接。用无菌水调整菌液浓度至108cfu/mL作为种子液备用。

3.1.2 枯草芽孢杆菌

一级扩大培养：将保藏的枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，选用50mL锥形瓶，内置15mL培养基，置于37℃，摇床震荡培养24h。二级扩大培养：LB培养基，选用250mL锥形瓶，内置70mL培养基，接菌量为5%，置于37℃，摇床培养24h。，取单菌落至20mL LB液体培养基中，200r/min过夜培养，取1mL菌液转接至100mLLB液体培养基中，培养6 ～8h后用无菌水调整菌液浓度至108cfu/mL作为种子液备用。培养温度均为37℃[7]。

3.1.3 酪酸梭菌

菌种活化：用灭菌10μL 枪头取适量-80℃保藏的菌液，在固体RCM平板（强化梭菌培养基）上划线，置于厌氧培养箱中 37℃恒温培养24-36 h，挑取单菌落接种于1.5 m L新鲜种子培养基中，37℃厌氧培养菌体 OD600约为2.0，然后用注射器吸取1.0 m L新鲜种子液接种到预装50 m L CGM（梭菌生长培养基）种子培养基的 100 m L 血清瓶中，在 37℃恒温生化培养箱中静置培养12~24 h 至菌体 OD600 约为 2.0。

扩大培养：将上述活化的菌液按5%（v/v）的接种量接种于含50 m L CGM培养基的100mL血清瓶中，然后在37°С恒温培养箱中静置培养至菌体 OD600达 2.0，此菌液可以作为摇瓶发酵或分批发酵种子液[8]。

3.1.4 复合菌剂种子液

将上述三种单一菌剂的种子液单独保存，只在接种时按1:1:1的比例分别添加至培养基。

3.2 固态发酵试验

3.2.1 固体发酵培养基的制备

分别将从市场购买的带肥膘猪肉破碎后的猪肉匀浆与麦麸采用直接干燥法测定水分含量（新鲜猪肉水分含量一般为64%-68%）、采用元素分析仪（生物所具有，只需制备好样品送检）测定总碳含量和总氮含量。采用混合后碳氮比为25:1左右的标准将猪肉匀浆与麦麸按比例混合起来放入100ml血清瓶中制得固体发酵培养基。并根据猪肉匀浆样品和麦麸样品的水分含量测得固体培养基的初始水分含量。再添加适量无菌水将固体培养基的初始含水量调配为50%左右。

3.2.2 固体培养基初始指标的测定

分别用凯氏定氮法、甲醛法、索氏抽提法（or紫外分光光度法or红外测油仪）测定固体培养基初始的粗蛋白百分含量、氨基态氮含量、脂肪含量。

3.2.3 单一菌剂与复合菌剂接种发酵实验

分别将三种单一菌剂单独接种于固态培养基中，接种量均为3%。复合菌剂组采用（1%+1%+1%）的比例接种。培养基中50%的初始含水量，初始pH 自然，发酵温度为35℃，发酵时间为4 d，每个处理重复3 次。发酵优化效果的评价以底物中粗蛋白减少率，氨基态氮变化量、油脂降解率为指标。

3.3 评估指标及其测定方法

3.3.1 粗蛋白百分含量和总蛋白氮含量

采用凯氏定氮法[9]:粗蛋白含量=蛋白氮含量×6.25。

称取充分混匀的固体试样0.2g~2g、半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g(约当于30mg~40mg氮),精确至0.001g,至消化管中,再加入0.4g硫酸铜、6g硫酸钾及20mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420℃之后,继续消化1h,此时消化管中的液体呈绿色透明状,取出冷却后加入50mL水,于自动凯氏定氮仪(使用前加入氢氧化钠溶液,盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A 或B的硼酸溶液)上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。

式中:

X ———试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g/100g);

V1 ———试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(mL);

V2 ———试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(mL);

c ———硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度,单位为摩尔每升(mol/L);

0.0140———1.0mL硫酸[c (1/2H2SO4)=1.000mol/L]或盐酸[c(HCl)=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量,单位为克(g);

m ———试样的质量,单位为克(g);

V3 ———吸取消化液的体积,单位为毫升(mL);

F ———氮换算为蛋白质的系数

100 ———换算系数。

蛋白质含量≥1g/100g时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g/100g时,结果保留两位有效数字。

注:当只检测氮含量时,不需要乘蛋白质换算系数F。

3.3.2 氨基态氮

采用甲醛法[10]:精确称取固态试样5 g 于250 mL烧杯中，加入40 mL 蒸馏水。电炉加热煮沸2～3 min。冷却至室温，上清液转移定容至50 mL 容量瓶，吸取10 mL 上清液，使用pH计调至8.20后加入甲醛溶液10 mL，用0.5 mol /L 氢氧化钠标准溶液滴定至9.20为终点，记下消耗氢氧化钠体积并计算氨基态氮含量。同时做试剂空白实验，计算方法如下:

Y ：氨基态氮含量( 以氮计) /mg /g;

V0：样品加入甲醛后用去氢氧化钠标准溶液体积/mL;

V ：试剂空白加入甲醛后用去氢氧化钠标准溶液体积/mL;

Vl ：吸取稀释液体积/mL;

N ：NaOH 标准溶液的浓度/mol /L;

0.014：消耗1 mL NaOH 标准溶液相当氮的毫克当量/g。

3.3.3 油脂降解率

（1）采用索氏抽提法[11]：

① 取样

固体试样:称取充分混匀后的试样2g~5g,准确至0.001g,全部移入滤纸筒内。

液体或半固体试样:称取混匀后的试样5g~10g,准确至0.001g,置于蒸发皿中,加入约20g石英砂,于沸水浴上蒸干后,在电热鼓风干燥箱中于100℃ ±5℃干燥30min后,取出,研细,全部移入滤纸筒内。蒸发皿及粘有试样的玻璃棒,均用沾有乙醚的脱脂棉擦净,并将棉花放入滤纸筒内。

② 抽提

将滤纸筒放入索氏抽提器的抽提筒内,连接已干燥至恒重的接收瓶,由抽提器冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚至瓶内容积的三分之二处,于水浴上加热,使无水乙醚或石油醚不断回流抽提(6次/h~8次/h),一般抽提6h~10h。提取结束时,用磨砂玻璃棒接取1滴提取液,磨砂玻璃棒上无油斑表明提取完毕。

③ 称量

取下接收瓶,回收无水乙醚或石油醚,待接收瓶内溶剂剩余1mL~2mL时在水浴上蒸干,再于100℃±5℃干燥1h,放干燥器内冷却0.5h后称量。重复以上操作直至恒重(直至两次称量的差不超过2mg)。

④ 分析结果的表述

试样中脂肪的含量按下式计算:

式中:

X ———试样中脂肪的含量,单位为克每百克(g/100g);

m1 ———恒重后接收瓶和脂肪的含量,单位为克(g);

m0 ———接收瓶的质量,单位为克(g);

m2 ———试样的质量,单位为克(g);

100———换算系数。

计算结果表示到小数点后一位。

（2）采用紫外分光光度法[12-13]：将熟猪油溶解于石油醚（沸程60~90℃）中配制成1 g /L的标准溶液，量取0、2、4、6、8ml置于10 mL的容量瓶中，用石油醚定容，分别配制成浓度为0、200、400、600、800 mg /L的溶液。然后以纯石油醚作为参比溶液，在225 nm处测定OD值，并绘制标准曲线，得到回归方程后，通过以下方程式计算油脂降解率。

油脂降解率=(C0－C1)/C0

式中，C0为培养基中含油量;

C1为发酵样品中含油量;

（3）采用红外分光光度法[14]：生物所其他实验室有一台红外测油仪，师姐目前正在与该实验室的人接洽。

3.3.4 水分含量

采用国标GB5009.3—2016第一法（直接干燥法）

取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶,置于101 ℃~105 ℃干燥箱中,瓶盖斜支于瓶边,加热1.0h,取出盖好,置干燥器内冷却0.5h,称量,并重复干燥至前后两次质量差不超过2mg,即为恒重。将混合均匀的试样迅速磨细至颗粒小于2mm,不易研磨的样品应尽可能切碎,称取2g~10g试样(精确至0.0001g),放入此称量瓶中,试样厚度不超过5mm,如为疏松试样,厚度不超过10mm,加盖,精密称量后,置于101℃~105℃干燥箱中,瓶盖斜支于瓶边,干燥2h~4h后,盖好取出,放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入101℃~105℃干燥箱中干燥1h左右,取出,放入干燥器内冷却0.5h后再称量。并重复以上操作至前后两次质量差不超过2mg,即为恒重。

试样中的水分含量,按下式进行计算:

X =（m1 -m2）/（m1 -m3）×100

式中:

X ———试样中水分的含量,单位为克每百克(g/100g);

m1 ———称量瓶(加海砂、玻棒)和试样的质量,单位为克(g);

m2 ———称量瓶(加海砂、玻棒)和试样干燥后的质量,单位为克(g);

m3 ———称量瓶(加海砂、玻棒)的质量,单位为克(g);

100———单位换算系数。

水分含量≥1g/100g时,计算结果保留三位有效数字;水分含量<1g/100g时,计算结果保留两位有效数字。

3.4 复合发酵条件的优化

3.4.1 接种量单因素实验

将上述3 种种子液等比例混合制成复合菌剂。对接种量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%) 进行单因素实验，发酵培养基中50% 初始含水量，初始pH 自然，温度为35 ℃，时间4 d，每个处理重复3 次。发酵优化效果的评价以底物中粗蛋白减少率，氨基态氮变化量、油脂降解率为指标。

3.4.2 发酵温度单因素实验

对温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃) 进行单因素实验，接种量选择为上述最优接种量，发酵培养基中50% 初始含水量，初始pH 自然，发酵时间4 d，每个处理重复3 次。发酵优化效果的评价以底物中粗蛋白减少量，氨基态氮变化量、油脂降解率为指标。

3.4.3 初始含水量单因素实验

根据猪肉匀浆与麦麸单独测定的水分含量。根据不同添加物在培养基中的添加比例计算得出初始含水量，再添加适量无菌水调配出初始含水量( 40%、45%、50%、55%、60%)的五种发酵培养基再进行单因素实验，选择最优温度和接种量。初始pH 自然，发酵时间4 d，每个处理重复3 次。发酵优化效果的评价以底物中粗蛋白减少量，氨基态氮变化量、油脂降解率为指标。

3.4.4 发酵时间单因素实验

对发酵时间(2、3、4、5、6d) 进行单因素实验，选择最优接种量、初始含水量和温度，其他条件初始pH 自然，每个处理重复3 次。发酵优化效果的评价以底物中粗蛋白减少量，氨基态氮变化量、油脂降解率为指标。

3.4.5 数据分析

运用响应面法设计试验，筛选出主要影响因子接种量、发酵温度、初始含水量及发酵时间，分别以蛋白质降解率和油脂降解率为响应值挑选单因素实验中最具有代表性和平行性最好的三因素三水平来建立二次回归方程，并借助Design Expert8.0.6软件[15]进行3因素3水平的数据分析并分别确定复合菌剂降解蛋白质与油脂的最优条件。

4 现阶段疑问

1对于菌种来源：还未确定是需要从专业机构购买-80℃保藏下的菌种还是直接使用上次用过的直投式菌粉。

2 对于油脂降解率的检测方法：按理论来说，索氏抽提法是结果最为精准只是步骤耗时最为繁琐的方法。可是经过上次帮丁悦师姐测定她样品的实验。我发现学校里现存的脂肪抽提仪测定结果的平行性与规律性都很差。所以才找了其他文献中记载的紫外与红外两种方法。紫外的问题在于此法主要适合于水质中微量油脂的定量，并且因为所用的溶剂为石油醚，所采用的波长为225nm，可能会造成将石英比色皿中的板块黏结材料胶溶解从而损坏石英比色皿的问题。红外的问题在于需要用到生物所才有的红外测油仪，并且前处理繁琐，需用到有毒有机试剂可能需要佩戴防毒面具才能操作。现阶段，丁悦师姐因为她的实验已经购买了相关试剂，并且在与有红外测油仪的实验室管理人员正在接洽借用仪器的事宜。我的想法是先使用学校的脂肪测定仪先测着，等师姐跑完红外法，如果确定红外法实测定结果很精准，就改用红外法。

3 对于复合菌剂的菌种构成比例：因为涉及到3种菌，并且后续的单因素实验中还有与之相关的接种量一项，并且响应值有脂肪和蛋白质两个，如果要再将3种菌的构成比例设计为一项响应面分析的因素，可能实验的工作量就太多了，我现在有点不知道怎么安排这个问题，就很笼统的和预实验一样写为1:1:1。

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